细胞名称:鸭胚胎成纤维细胞
Duck embryo
细胞培养条件:D/F12+10%FBS+1%p/s+0.005mg/ml胰岛素+5ng/mlBfGF+1ug/ml氢化的松+50ug/ml抗坏血酸(维C)+7.5mM L-Gln
生长状态:贴壁生长
细胞是生物学实验的重要材料,也是生物细胞学实验的基础,药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。而细胞培养,受人员操作和环境条件的影响比较大,在细胞培养中常常会遇到很多的细节问题,而每个问题都有可能导致细胞培养的失败。我们汇总了细胞实验室多年来的细胞培养经验分享给大家,希望能给大家的细胞培养带来帮助。
一.细胞系身份需明确
我们之所以选定某种细胞系开展实验,是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性,疾病特性,功能特性,基因表达特性等。一旦用错了细胞株,对我们研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。
而近年来,多个机构发现细胞系在培养和流通过程中,出现了很严重的交叉污染。据不*统计,单就HeLa细胞系导致的污染致使3万多篇论文结果的准确性存在问题(doi:10.1371/journal.pone.0186281)。而这种情况不仅仅限于HeLa细胞。多个机构研究人员检测发现超过451个细胞系已被其它细胞*吸收,在所检测细胞中污染占比46%,可见细胞交叉污染的现象非常普遍。因此,做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株,最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。
目前,STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的*和准确的方法之一,是ATCC等机构认定的金标准。不过可惜的是并非所有细胞均可进行STR鉴定,目前只有大部分的人源细胞株和45个种类的小鼠细胞株可以进行鉴定。其他细胞株可以结合细胞形态、特性和物种鉴定来进行确认。
二.培养、传代、冻存和复苏
1.准备工作:
根据培养细胞的特性,提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件,以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时,充分了解到细胞的生长特性和形态特征,便于后续的培养观察。
2.贴壁细胞传代:
1)移弃使用过的细胞培养液。(不要直接倒掉,避免瓶口残留导致易污染)
2)使用不含钙镁离子的平衡盐溶液(PBS)冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液,以避免搅动细胞层,前后摇晃容器数次,最后移弃冲洗液。(洗去残留的血清,避免影响胰酶的活性。)
3)以 25 cm2的培养瓶为例,向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA(请根据各细胞的指引使用合适的浓度)消化液,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,几分钟内,会发现胞质回缩、细胞间隙增大,倾斜培养瓶时细胞层能自然流下,此时应加入2-3ml含血清的*培养液终止消化(细胞解离所需时间请参考各细胞的指引,并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况)。另外,并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离,请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。
4)使培养瓶倾斜,吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面,重复该动作2-3次,使所有细胞沿瓶底流下,再轻柔地把细胞吹打成单个悬液(吹打过程中应避免气泡的产生)。
PS:对于难消化的细胞,尽量不要通过用力吹打的方式来处理,以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来,及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化,避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。
5)把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。
6)加入新的含血清*培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,补足新的含血清*培养液,轻轻摇晃混匀。
7)放到37 ℃ 孵育,第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。
3.悬浮细胞传代:
因悬浮生长细胞不贴壁,故传代时不必采用酶消化方法,而可直接传代或离心收集细胞后传代。
1)直接传代时,静置5-10分钟,待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后,吸掉1/2-2/3原培养液,补足新鲜的含血清*培养液,混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,轻轻摇晃混匀。
2)离心传代时,将细胞连同培养液一并转移到离心管内,800-1000rpm离心3-5分钟,移弃上清后,加入新鲜的含血清*培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,补足新鲜的含血清*培养液,轻轻摇晃混匀。
3)放到37 ℃ 孵育,第二天显微镜下观察细胞的情况。
4.贴壁悬浮混合型细胞传代:
先将悬浮的细胞收集,再参考“贴壁细胞传代"方法进行消化收集,一起接种到培养器皿中。
PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高,培养中最好参考指南控制好细胞密度,不能过密也不能过稀。
5.细胞冻存:
1)按照“细胞传代步骤"中的方法收集细胞。
2)加入细胞冻存液(一般10%DMSO+对应细胞的*培养液),使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml,移入细胞冻存管中。
3)程序降温(以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例):4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。(一定不能省略4℃的30min,否则冻存液无法渗透到细胞,易产生冰晶导致细胞受损。)
6.细胞复苏:
1)取出贮存的细胞,待液氮挥发后,马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化(通常2min内,时间长了细胞状态会受影响)。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂,操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。
PS:干冰运输的冻存细胞,收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中,至少3d后再进行复苏操作。
2)转移到无菌操作台,75%酒精擦拭冻存管外部。
3)将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清*培养液离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟,移弃上清。
4)重新加入经预热的含血清*培养液重悬细胞,以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。
5)放到37℃孵育,第二天显微镜下观察细胞的情况。
大鼠 肺微血管内皮细胞
大鼠 肺动脉内皮细胞
大鼠 肺动脉平滑肌细胞
大鼠 肺动脉外膜成纤维细胞
大鼠 II型肺泡上皮细胞
大鼠 气管上皮细胞
大鼠 气管平滑肌细胞
大鼠 支气管上皮细胞
大鼠 支气管平滑肌细胞
大鼠 肺成纤维细胞
大鼠 肺巨噬细胞
大鼠 肺微血管周细胞
大鼠 心肌细胞
大鼠 心肌成纤维细胞
大鼠 主动脉内皮细胞
大鼠 主动脉平滑肌细胞
大鼠 主动脉外膜成纤维细胞
大鼠 冠状动脉内皮细胞
大鼠 冠状动脉平滑肌细胞
大鼠 颈动脉内皮细胞
大鼠 颈动脉平滑肌细胞
大鼠 腹腔主动脉内皮细胞
大鼠 腹腔主动脉平滑肌细胞
大鼠 腹腔主动脉外膜成纤维细胞
大鼠 股动脉内皮细胞
大鼠 股动脉平滑肌细胞
大鼠 心肌干细胞
大鼠 主动脉弓平滑肌细胞
大鼠 主动脉弓内皮细胞
大鼠 心脏微血管内皮细胞
大鼠 颈动脉成纤维细胞
大鼠 颈静脉内皮细胞
大鼠 主动脉瓣膜间质细胞
大鼠 食管上皮细胞
大鼠 食管平滑肌细胞
大鼠 食管成纤维细胞
大鼠 胃粘膜上皮细胞
大鼠 胃平滑肌细胞
大鼠 胃成纤维细胞
大鼠 小肠黏膜上皮细胞
大鼠 小肠平滑肌细胞
大鼠 小肠隐窝上皮细胞
大鼠 小肠成纤维细胞
大鼠 结肠粘膜上皮细胞
大鼠 结肠平滑肌细胞
大鼠 结肠成纤维细胞
大鼠 胆囊上皮细胞
大鼠 肝内胆管上皮细胞
大鼠 肝外胆管上皮细胞
大鼠 肝实质细胞
大鼠 肝星状细胞
大鼠 肝窦内皮细胞
大鼠 肝Kupffer细胞
大鼠 结肠神经元细胞
大鼠 肝间质细胞
大鼠 肝成纤维细胞
大鼠 肠间质细胞
大鼠 肾小管上皮细胞
大鼠 肾小球系膜细胞
大鼠 肾小球内皮细胞
大鼠 肾足细胞
大鼠 输尿管上皮细胞
大鼠 输尿管平滑肌细胞
大鼠 膀胱上皮细胞
大鼠 膀胱平滑肌细胞
大鼠 膀胱基质成纤维细胞
大鼠 前列腺上皮细胞
大鼠 前列腺成纤维细胞
大鼠 肾周细胞
大鼠 甲状腺上皮细胞
大鼠 甲状腺成纤维细胞
大鼠 胰腺星状细胞
大鼠 胰岛细胞
大鼠 垂体细胞
大鼠 胸腺细胞
大鼠 胸腺基质细胞
大鼠 颌下腺上皮细胞
大鼠 肾上腺皮质细胞
大鼠 肾上腺髓质细胞
大鼠 精原细胞
大鼠 睾丸支持细胞
大鼠 海绵体平滑肌细胞
大鼠 卵巢颗粒细胞
大鼠 卵巢间质细胞
大鼠 输卵管上皮细胞
大鼠 输卵管平滑肌细胞
大鼠 子宫内膜上皮细胞
大鼠 子宫内膜平滑肌细胞
大鼠 卵巢表面上皮细胞
大鼠 乳腺上皮细胞
大鼠 乳腺成纤维细胞
大鼠 卵巢内膜细胞
大鼠 子宫内膜间质细胞
大鼠 睾丸间质细胞
大鼠 子宫成纤维细胞
大鼠 骨细胞
大鼠 成骨细胞
大鼠 软骨细胞
大鼠 滑膜成纤维细胞
大鼠 骨骼肌细胞
大鼠 骨骼肌成纤维细胞
大鼠 纤维环细胞
大鼠 髓核细胞
大鼠 破骨细胞
大鼠 皮肤成纤维细胞
大鼠 角质形成细胞
大鼠 表皮干细胞
大鼠 前脂肪细胞
大鼠 脂肪微血管内皮细胞
大鼠 真皮毛乳头细胞
大鼠 外根鞘细胞
大鼠 毛囊角质细胞
大鼠 骨髓间充质干细胞
大鼠 脂肪干细胞
大鼠 滑膜间充质干细胞
大鼠 B淋巴细胞
大鼠 T淋巴细胞
大鼠 单核细胞
大鼠 DC细胞
大鼠 NK细胞
大鼠 内皮祖细胞
大鼠 胸腺上皮细胞
大鼠 胸腺成纤维细胞
大鼠 脾基质细胞
大鼠 脾源性内皮祖细胞
大鼠 淋巴管内皮细胞
大鼠 淋巴管成纤维细胞
大鼠 骨髓肥大细胞
大鼠 骨髓单核细胞
大鼠 脾淋巴细胞
大鼠 骨髓巨噬细胞
大鼠 脑微血管内皮细胞
大鼠 脑动脉血管内皮细胞
大鼠 脑血管周细胞
大鼠 脑膜细胞
大鼠 脑皮层神经元细胞
大鼠 海马神经元细胞
大鼠 脊髓神经元细胞
大鼠 雪旺细胞
大鼠 星形胶质细胞
大鼠 小胶质细胞
大鼠 少突胶质细胞
大鼠 神经胶质细胞
大鼠 脑动脉平滑肌细胞
大鼠 神经干细胞
大鼠 脑血管成纤维细胞
大鼠 DRG神经元细胞
大鼠 下丘脑神经元细胞
大鼠 角膜上皮细胞
大鼠 角膜基质细胞
大鼠 视网膜色素上皮细胞
大鼠 晶状体上皮细胞
大鼠 结膜成纤维细胞
大鼠 结膜上皮细胞
大鼠 脉络膜微血管内皮细胞
大鼠 脉络膜成纤维细胞
大鼠 视网膜微血管内皮细胞
大鼠 牙周膜成纤维细胞
大鼠 牙周膜干细胞
大鼠 牙髓干细胞
大鼠 口腔黏膜上皮细胞
大鼠 舌表皮细胞
大鼠 鼓膜上皮干细胞
大鼠 角膜内皮细胞
大鼠 巩膜上皮细胞
大鼠 视网膜mulller细胞
大鼠 胎盘间充质干细胞
大鼠 胚胎成纤维细胞
鸭胚胎成纤维细胞
三.污染防治
1.细菌污染
细菌污染是细胞培养中最常见的污染,主要由操作不慎或使用了灭菌不*的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。
好氧菌增殖分裂迅速,感染24h内即可使培养基浑浊;厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢,需要较长时间才会观察到浑浊现象。
污染处理:由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥,所以出现污染后加双抗(青霉素&链霉素,Penicillin + Streptomycin)一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周,颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周,效果相对还不错。
2. 真菌污染
细胞培养中最常见的污染真菌有:烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
左边这张是比较典型的霉菌污染的图片,右图是酵母污染,镜下可以看到明显的出芽形态。
污染处理:可用100ug两性霉素/T25瓶,处理一周。
注:性较大,需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。
相关同类产品: |
TOV-112D 人上皮性卵巢癌细胞 | OVCAR-8/ADR 人卵巢癌腺癌阿mei素耐药细胞 | SK-OV-3+luc 人卵巢癌细胞荧光素酶标记 |
OVCAR-8+luc 人卵巢癌腺癌细胞荧光素酶标记 | A2780+GFP 人卵巢癌细胞+GFP | Mahlavu 人肝癌细胞 |
人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞 DB | MIA PaCa-2 胰腺癌细胞系 | NCI-H1975细胞 |
下一篇:MDBK牛肾细胞