细胞培养过程中应该注意哪些问题?
#1细胞培养步骤一般包括:解冻、培养、分盘、冻存。基本上都遵循这个步骤,细胞转染过程,我们往往发生在步骤3,在做细胞功能性实验时,往往在步骤2,解冻和冻存就是细胞的储藏和分离的过程。
#2首先我们要获得细胞,一般受大家比较认可的细胞库有1962年ATCC建立的CELL LINES、中科院、DSMZ等机构。
#3细胞解冻要求37度快速解冻,另外就是注意不同细胞的培养条件。
#4同规格培养器皿所需要的细胞生长密度也不同,如下图:
#5细胞生长会产生各种代谢废物,造成培养液PH变化,所以培养过程中,遇到细胞培养液变化较为明显时,要及时更换培养液,保证细胞的正常生长。
#6细胞离心时也要注意,强烈的离心力会使得细胞大量积聚离心管底部,造成大量细胞挤压破碎,一般不要超过300g,5-10min即可。
#7此外离心机分为固定转角离心机和自由转角离心机,固定转角的离心机会使细胞堆积在侧壁,容易造成一些细胞离心不充分,造成细胞的丢失,相反,自由转角离心机能很好解决这个问题所以,我们一般尽量使用自由转角离心机。
1、细胞系(细胞株)
细胞系是来自多细胞生物体的细胞群体,其通常不会无限增殖,但是由于突变,逃避了正常细胞的衰老,从而可以持续分裂的一种细胞的集合。
因此,细胞可以在体外长时间生长。细胞系是研究多细胞生物体的生物化学和细胞生物学的非常重要的工具,例如信号通路、肿瘤杀伤、细胞增殖、细胞周期、突变分析、基因表达、蛋白表达、细胞分化等等。此外,永生化的细胞系也已经在生物技术中得到应用,比如建立新来源、新突变的细胞系。
2、克隆细胞株
从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群,称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群,亦可称之为亚株。
3、二倍体细胞
细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同( 2n 细胞占 75%或 80%以上)的细胞群,称二倍体细胞培养。如仅数目相同,而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期,故属有限细胞系。
但随供体年龄和组织细胞的不同,二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代±10代,人胚肾只有8—10代,人胚神经胶质细胞15—30 代;如从老龄个体取材培养,则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用,一般在初代或 2— 5 代即大量冻存作为原种,用时再进行增殖培养,用后再继续冻存,可供长期使用和延缓细胞的衰老。
4、初代培养(原代细胞培养)
原代培养是从供体获取组织后的第一次培养,其优点是:组织和细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大的变化,具有二倍体遗传性状,在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别),在一定程度上能反映体内状态。原代培养所在机能上的改变,主要是表型上的改变,不一定为体细胞突变。从理论上讲,人们有可能创造出一种条件,使原代培养细胞恢复体内时的机能,因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用原代培养细胞做实验,如药物测试等效果也很好;原代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。有一点也要注意到,原代培养的组织是由多种细胞成分组成的,比较复杂。
即使培养的是较纯的单一类型的细胞,如上皮或成纤维细胞,也仍存在着异质性,在分析细胞生物学特性时仍有一定困难。此外由于不同供体不同批次差异及其它一些原因,细胞生长效果有时也会不一致。
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