澳洲源胎牛血清(F8687-500ML)

产品名称：澳洲胎牛血清

货号：F8687

规格：500ml

品牌：SIGMA

细胞培养最基本的是做好污染防控，包括微生物污染的防控和细胞系间交叉污染的防控。

实验中需保持良好的操作习惯，所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。实验室也需定期清洁与消毒。

※血清与培养基

通常血清的添加比例为10%，当然也可根据细胞状态和生长速率适当增加或减少添加比例。在更换血清品牌或者批次时，最好需对血清的品质进行验证，防止对实验造成影响。

对于培养基，目前商品化的比较成熟，稳定性也较好。如若需自配培养基时，过滤前搅拌时间不宜过长（培养基中营养丰富，细菌常温下20min就可繁殖一代，其代谢产物会对培养基的品质产生影响）。培养基过滤除菌后，应对培养基进行无菌验证，防止污染。

※细胞培养瓶

目前商品化的细胞培养瓶主要为瓶盖是否带气孔两种。其中不带透气孔细胞培养瓶拧紧后需适当回旋瓶盖，保证CO2能顺利进入细胞培养瓶。

细胞培养过程中，对于适应能力强的肿瘤细胞，可在传代3-4次后更换新的细胞培养瓶。对于非肿瘤细胞系如293T，HEK293等细胞，建议每次传代更换新的细胞培养瓶来保证细胞状态。

※细胞传代

正常细胞形态较好，轮廓清晰，边缘透亮，细胞增殖状况良好。当贴壁细胞长到密度90%时，需进行传代。

传代时通常使用胰酶消化法。该方法又分为干消化法和湿消化法。

干消化法：胰酶浸润后弃去胰酶，待细胞变圆后加入新鲜培养基吹下后再进行细胞传代。

湿消化法：待细胞变圆，肉眼观察下成流沙状脱落时即可加入新鲜培养基终止消化，1000rpm离心5min,弃去上清，用新鲜培养基重悬传代。

吹打细胞时，手法要轻柔，避免吹打出气泡，造成细胞因内外压差破裂，同时需避免刮到瓶壁影响细胞的贴壁。

不同细胞的贴壁能力不同，消化时间不同；不同细胞细胞间连接强度不一样，消化时间不同；同一细胞生长状状况不同，消化时间不同。消化时适时观察细胞形态，避免因过度消化影响细胞活性。

传代间隔时间和传代比例因细胞而异。细胞传代过程中，当细胞出现状态不好或者污染时及时弃去细胞，重新复苏。

※细胞冻存与复苏

当细胞生长状况较好或者代数较早时，需及时大量的冻存。

细胞冻存液比例为培养基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。细胞冻存密度通常为1-3×106个/ml。细胞冻存采用慢冻方式，减少冰晶形成，避免细胞损伤。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞复苏时升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。38℃水浴不时摇动，在1分钟内使其*融化，1000rpm离心5min,弃去上清，用新鲜培养基重悬移入培养瓶中。

※用真诚感动细胞

俗话说，心诚则灵。对待细胞培养也应如此，“自己要用的细胞自己养"，多去观察细胞生长状态。

所谓“知彼知己，百战不殆"。培养细胞需要我们的耐心以及不断的摸索和积累，了解了每种细胞各自的习性后，再“傲娇"的细胞也能在我们的“真诚"下认真“成长"※※※※

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贴壁细胞传代：

1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）

2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的*培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另外，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。

4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。

PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。

5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。

6）加入新的含血清*培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清*培养液，轻轻摇晃混匀。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

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