名称：人正常胰腺类器官培养基试剂盒

货号：WS002-100-KIT/WS002-500-KIT

规格：100ml/500ml

品牌：WinSera

人正常胰腺类器官培养基是一款促进人正常胰腺类器官体外形成和扩增的培养基。该产品为无菌的液体混合系统，含有维持目的细胞生长所必需的氨基酸、维生素、有机和无机化合物以及生长因子等。该培养基的du特配方可以提供一个合适的细胞所需营养环境，促进人正常胰腺类器官的体外生长和扩增。
一、试剂盒组成：

、1、原代
（1）将组织放入含有特殊组织保存液E的组织取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离，拍照并登记信息。
（2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的人正常胰腺类器官培养缓冲液B备用。
（3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用人正常胰腺类器官培养缓冲液B清洗三次后，利用眼科jian或手术dao将肿瘤组织jian切成体积约为 1-3 mm3的组织块。
（4）组织用人正常胰腺原代组织xiao化液C消化，37℃震荡消化10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）。
（5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70 um 以下的细胞簇后，加入三倍体积人正常胰腺类器官培养缓冲液B终止消化。
（6）使用100 um孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300 g富集离心5 min后移去上清，添加人正常胰腺类器官培养缓冲液B重新重悬离心。
（7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶（abs9495）重悬铺板。
（8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25 ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15 min成胶，添加人正常胰腺类器官培养基A（恢复室温）进行培养。

2、类器官传代培养
（1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2 ml 4℃类器官缓冲液B放置2 min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15 ml离心管中，4℃静置10 min。（每6-8孔为一组）
（3）A：类器官数量不足或体积较小时： 离心5 min弃去上清，添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B重悬移入1.5 ml离心管，300 g离心5 min弃去液体进行第4步。
         B：类器官数量较多或体积较大时：离心5 min弃去上清，添加适量类器官传代消化液D消化2-3 min，添加人正常胰腺类器官缓冲液B终止消化，离心5 min弃去混合液，添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B重悬移入1.5 ml离心管，300 g离心5 min弃去液体进行第4步。
（4）类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25 ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15 min添加500 ul人正常胰腺类器官培养基A。

3、类器官冻存
（1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2 ml 4℃类器官缓冲液B放置2 min。
（2）移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15 ml离心管中，4℃静置10 min。（每6-8孔为一组）
（3）离心5 min弃去上清，添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B再次重悬，300 g离心5 min弃去液体。
（4）添加适量类器官冻存液F，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积4 ml。
（5）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏
（1）取10 ml人正常胰腺类器官培养缓冲液B于15 ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2 min内wan全融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15 ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300 g离心5 min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B重悬移入5 ml离心管300 g离心5 min。
（5）基质胶重悬，每孔25 ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15 min成胶，添加500 ul人正常胰腺类器官培养基A。
（1）将组织放入含有特殊组织保存液E的组织取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离，拍照并登记信息。
（2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的人正常胰腺类器官培养缓冲液B备用。
（3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用人正常胰腺类器官培养缓冲液B清洗三次后，利用眼科jian或手术dao将肿瘤组织jian切成体积约为 1-3 mm3的组织块。
（4）组织用人正常胰腺原代组织xiao化液C消化，37℃震荡消化10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）。
（5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70 um 以下的细胞簇后，加入三倍体积人正常胰腺类器官培养缓冲液B终止消化。
（6）使用100 um孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300 g富集离心5 min后移去上清，添加人正常胰腺类器官培养缓冲液B重新重悬离心。
（7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶（abs9495）重悬铺板。
（8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25 ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15 min成胶，添加人正常胰腺类器官培养基A（恢复室温）进行培养。

2、类器官传代培养
（1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2 ml 4℃类器官缓冲液B放置2 min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15 ml离心管中，4℃静置10 min。（每6-8孔为一组）
（3）A：类器官数量不足或体积较小时： 离心5 min弃去上清，添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B重悬移入1.5 ml离心管，300 g离心5 min弃去液体进行第4步。
         B：类器官数量较多或体积较大时：离心5 min弃去上清，添加适量类器官传代消化液D消化2-3 min，添加人正常胰腺类器官缓冲液B终止消化，离心5 min弃去混合液，添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B重悬移入1.5 ml离心管，300 g离心5 min弃去液体进行第4步。
（4）类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25 ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15 min添加500 ul人正常胰腺类器官培养基A。

3、类器官冻存
（1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2 ml 4℃类器官缓冲液B放置2 min。
（2）移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15 ml离心管中，4℃静置10 min。（每6-8孔为一组）
（3）离心5 min弃去上清，添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B再次重悬，300 g离心5 min弃去液体。
（4）添加适量类器官冻存液F，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积4 ml。
（5）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏
（1）取10 ml人正常胰腺类器官培养缓冲液B于15 ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2 min内全部融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15 ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300 g离心5 min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量人正常胰腺类器官缓冲液B重悬移入5 ml离心管300 g离心5 min。
（5）基质胶重悬，每孔25 ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15 min成胶，添加500 ul人正常胰腺类器官培养基A。

三、储存/保存方法

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温馨提示：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究

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