人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞
nk-92mi细胞
NK-92MI专用培养基
悬浮
淋巴母细胞样 成团聚集
细胞传代
18.细胞传代的方法都有哪些?
根据不同的细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代;部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代;悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。
19.原代培养的传代应注意的问题?
细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前,不要急于传代;原代培养时细胞多为混杂生长,不同的细胞有不同的消化时间,因此要根据需要注意观察及时处理,并根据不同细胞对胰蛋白酶的耐受时间而分离和纯化所需要的细胞;
吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤;传代时细胞接种数量要多一些,使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增值;随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。
20.使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的?应如何处理?
EDTA作用较胰蛋白酶缓和,主要作用在于能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+,这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞*分散,因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用,效果较好。常用比例为1:1或者2份EDTA:1份胰蛋白酶。EDTA的工作液浓度为0.02%,用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA,在终止消化前,需用缓冲液将消化液清除后才能加培养液。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于 –20 ℃,避免反复冷冻解冻造成胰蛋白酶的活性降低,并可减少污染的机会。
21.欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?
欲回收动物细胞,其离心速率一般为800~1000 rpm,5~10 分钟,过高的转速,将造成细胞死亡。
22.细胞的接种密度为何?
依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。
23.细胞交叉污染的可能原因?
多种细胞系进行维持传代操作时,各细胞系所需的器材和溶液没有严格分开,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。
细胞冻存
24.冷冻培养基为什么要加DMSO?
因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冻存时,细胞内外的水分都会很快形成冰晶,冰晶的形成将造成细胞损伤,还可引起细胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保护剂。这两种细胞无明显毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高包膜对水的通透性。
25.DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何?
冷冻保存使用的 DMSO 等级,必须为 Tissue culture grade 的 DMSO,其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于 4 ℃,避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质,并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO,则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。
26.欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?
冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
27.冷冻保存细胞的方法?
冷冻保存方法一:冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →-20 ℃ 30 分钟 → -80 ℃ 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 长期储存。
冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下, 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中,存活率稍微降低一些。
28.细胞冻存太多会不会浪费?
每一种细胞系都应有充足的冻存储备,防止由于细胞污染等因素造成的细胞系的绝种,而且每一批次培养的细胞状态都不同,应该挑选几个状态较好的批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多,造成细胞衰老或者发生改变。
人原代乳腺癌成纤维细胞永生化
人原代软骨细胞永生化
人脐静脉内皮原代细胞+GFP 原代细胞+GFP
人神经母细胞瘤细胞 sh-sy5y转染突变型
人神经母细胞瘤细胞 sh-sy5y转染野生型
小鼠肺成纤维细胞永生化
小鼠附睾脂肪干细胞永生化
小鼠肾小球系膜细胞永生化
小鼠胰腺星状细胞永生化
小鼠脂肪干细胞永生化
麝香鼠原代乳腺上皮细胞永生化
小鼠骨髓巨噬细胞永生化
小鼠角膜上皮细胞永生化
小鼠肝星状细胞永生化
大鼠脑微血管内皮细胞永生化
大鼠内皮祖细胞永生化
大鼠脂肪干细胞+RFP 原代细胞+RFP
鸡胚成纤维细胞永生化
鸡气管黏膜上皮细胞永生化
鸭脑微血管内皮细胞永生化
鸭胚成纤维细胞永生化 Duck embryo
鸭胚肝间质细胞永生化
羊睾丸间质细胞永生化
湖羊瘤胃上皮细胞永生化
山羊乳腺上皮细胞永生化
猪脂肪干细胞永生化
猪扁桃体上皮细胞永生化
猪肝星状细胞永生化
猪骨骼肌卫星细胞永生化
猪子宫内膜上皮细胞永生化
猪鼻腔粘膜上皮细胞永生化
猪外周血单个核细胞(PBMC)永生化
猪主动脉内皮细胞永生化
猪小肠上皮细胞永生化
雪貂鼻腔粘膜上皮细胞永生化
兔子宫内膜上皮细胞永生化
兔肝脏间质细胞永生化
nk-92mi细胞
01冷冻管应如何解冻?
取出冷冻管后,须立即放入37 °C水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。
注:操作时戴好手套,防止冻伤;带上防护眼镜可以防止液氮罐里刚刚拿出来的管子液氮爆炸……
复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶。冻存细胞从液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1 分钟内全部融化(不要超过3 分钟)。解冻后的细胞可以直接接种到含有*培养液的细胞培养瓶中直接进行培养,24小时后再用新鲜*培养液替换旧培养液,以去除DMSO。如果细胞对冷冻保护剂特别敏感,解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂,然后再接种到含*生长培养液的培养瓶中。
02细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除DMSO?
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,可直接放入10-15ml新鲜培养基,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
03细胞培养时能否更换培养基种类?
首先得确定现在用的培养基是否适合您的细胞生长。细胞培养过程中,细胞增殖和形态正常的情况下最好不要更换培养基,细胞都有各自适应的培养基,更换培养条件,细胞可能无法快速适应,导致细胞死亡。若必须更换,可尝试半换,让细胞逐渐适应新的培养基。
更换培养基的方法:如果是贴壁生长的细胞, 一般可以直接把培养液吸掉, 再加入新的。加的时候注意不要对着长细胞的那一面。如果是悬浮型的, 就需要低速离心 (把所有的细胞和培养液转移到离心管里, 或有些离心机配有直接离心细胞培养皿的装置), 然后再吸掉上清液。加入新的培养液使细胞重新悬浮。
04细胞培养时能否更换胎牛血清?
首先要确定更换胎牛血清的理由,如果细胞培养无异常的话,不建议随意更换不同品牌和来源的胎牛血清。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的来源(血源地)和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同地域和等级的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞死亡。如果是使用的胎牛血清出现了问题,比如保存不当或操作不当导致血清成分析出、混浊、污染等情况,可以优先更换同品牌、等级、批次的血清。如果是产品质量问题更换血清品牌的话,需要用一批细胞进行预实验才行,以保证细胞能够正常培养。另外大家在购买胎牛血清的时候要选择正规来源,非正规来源的胎牛血清有很多安全隐患,对实验室、操作人员、细胞培养、实验数据都有很大的影响。
05培养细胞时应使用多少浓度的二氧化碳?
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时,细胞培养时应使用10%CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时,则应使用5% CO2培养细胞。
06一般在拿到细胞后,应该注意什么?
收到细胞后先不要开盖,放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议对收细胞时的培养基拍一张照片,观察培养基的颜色和是否有漏液情况,显微镜下拍细胞100X,200X各一张),排除细胞本身污染的情况;收到细胞未开封,出现污染状况一般可以再申请免费发送一株细胞。
收到细胞时如无异常情况,请在显微镜下观察细胞密度,如为贴壁细胞,未超过80%汇合度时,将培养瓶中培养液吸出,留下10ml培养液继续培养;超过80%汇合度时,请按细胞培养条件传代培养。如为悬浮细胞,吸出培养液、1000转/分钟离心2分钟,吸出上清,管底细胞用新鲜培养基悬浮细胞后移回培养瓶。
细胞消化液建议使用PBS配制,慎用Hanks液配制。
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