细胞名称：绵羊肺成纤维细胞（原代永生化）

 OAR-L1  

细胞培养条件：DMEM+10%FBS+1%P/S

生长状态：贴壁生长

细胞是生物学实验的重要材料，也是生物细胞学实验的基础，药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。而细胞培养，受人员操作和环境条件的影响比较大，在细胞培养中常常会遇到很多的细节问题，而每个问题都有可能导致细胞培养的失败。我们汇总了细胞实验室多年来的细胞培养经验分享给大家，希望能给大家的细胞培养带来帮助。

一．细胞系身份需明确

 我们之所以选定某种细胞系开展实验，是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性，疾病特性，功能特性，基因表达特性等。一旦用错了细胞株，对我们研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。

而近年来，多个机构发现细胞系在培养和流通过程中，出现了很严重的交叉污染。据不*统计，单就HeLa细胞系导致的污染致使3万多篇论文结果的准确性存在问题（doi:10.1371/journal.pone.0186281）。而这种情况不仅仅限于HeLa细胞。多个机构研究人员检测发现超过451个细胞系已被其它细胞*吸收，在所检测细胞中污染占比46%，可见细胞交叉污染的现象非常普遍。因此，做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株，最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。

目前，STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的*和准确的方法之一，是ATCC等机构认定的金标准。不过可惜的是并非所有细胞均可进行STR鉴定，目前只有大部分的人源细胞株和45个种类的小鼠细胞株可以进行鉴定。其他细胞株可以结合细胞形态、特性和物种鉴定来进行确认。

二．培养、传代、冻存和复苏

1.准备工作：

根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件，以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。

2.贴壁细胞传代：

1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）

2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的*培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另外，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。

4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。

PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。

5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。

6）加入新的含血清*培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清*培养液，轻轻摇晃混匀。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

3.悬浮细胞传代：

因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。

1）直接传代时，静置5-10分钟，待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培养液，补足新鲜的含血清*培养液，混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，轻轻摇晃混匀。

2）离心传代时，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清*培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清*培养液，轻轻摇晃混匀。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

4.贴壁悬浮混合型细胞传代：

先将悬浮的细胞收集，再参考“贴壁细胞传代"方法进行消化收集，一起接种到培养器皿中。

PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高，培养中最好参考指南控制好细胞密度，不能过密也不能过稀。

5.细胞冻存：

1）按照“细胞传代步骤"中的方法收集细胞。

2）加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的*培养液），使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml，移入细胞冻存管中。

3）程序降温（以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例）：4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损。）

6.细胞复苏：

1）取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（通常2min内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。

PS：干冰运输的冻存细胞，收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。

2）转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。

3）将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清*培养液离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清。

4）重新加入经预热的含血清*培养液重悬细胞，以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

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绵羊肺成纤维细胞（原代永生化）

三.污染防治

1.细菌污染

细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要由操作不慎或使用了灭菌不*的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h内即可使培养基浑浊；厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢，需要较长时间才会观察到浑浊现象。

污染处理：由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥，所以出现污染后加双抗（青霉素&链霉素，Penicillin + Streptomycin）一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周，效果相对还不错。

2. 真菌污染

细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左边这张是比较典型的霉菌污染的图片，右图是酵母污染，镜下可以看到明显的出芽形态。

污染处理：可用100ug两性霉素/T25瓶，处理一周。

注：性较大，需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。

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