细胞培养 | 贴壁细胞与悬浮细胞的冻存步骤及关键要点

细胞培养 | 贴壁细胞与悬浮细胞的冻存步骤及关键要点

在细胞运输或长期不使用时，通常采用冻存方式进行保存。规范的细胞冻存操作直接影响后续复苏效果，因此冻存流程的严谨性至关重要。

本期编者将系统介绍贴壁细胞与悬浮细胞的冻存步骤及注意事项，帮助大家完善操作细节。

冻存前的准备：可提前配制冻存液；若使用无血清非程序冻存液，则无需自行配制，也无需使用程序降温盒。

一、贴壁细胞冻存步骤

1. 吸弃原有培养基，用PBS润洗细胞；

2. 吸弃PBS，加入胰酶消化，消化完成后使用wan全培养基终止，并吹打均匀制成细胞悬液；

3. 以1200 rpm（约250g）离心3分钟，che底吸弃上清，收集细胞沉淀；

4. 加入配制好的冻存液重悬细胞。一个长满约80%的T25培养瓶可冻存1支，或按细胞计数以3~5×10⁶ cells/支的密度冻存，每支冻存液用量建议为0.5~1 mL；

5. 分装至冻存管，拧紧管盖并做好标记；

6. 将冻存管置于程序降温盒中，于-80℃冰箱过夜；

7. 最后转移至液氮中长期保存。

二、悬浮细胞冻存步骤

1. 将细胞悬液直接以1200 rpm（约250g）离心3分钟，尽量吸弃上清，收集细胞沉淀；

2. 用配制好的冻存液重悬细胞。一个传代密度的T25培养瓶可冻存1支，或按细胞计数以3~5×10⁶ cells/支的密度冻存，每支推荐使用0.5~1 mL冻存液；

3. 分装至冻存管，拧紧管盖并清晰标记；

4. 置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱过夜；

5. 随后转移至液氮长期保存。

三、注意事项

1. 冻存液应提前配制，避免将DMSO直接加入细胞悬液；

2. 宜选择处于对数生长期、汇合度约80%–90%的细胞进行冻存，具体冻存密度可根据细胞特性调整；

3. 程序冻存盒、冻存液和wan全培养基等需恢复至室温再使用；

4. 冻存过程中应避免消化时间过长、吹打过猛、离心转速过高或时间过长，以防细胞损伤；

5. 细胞长期保存应置于液氮中，不建议在-80℃条件下长期存放；

6. 若无程序降温盒，可依次按以下步骤降温：室温→4℃（20分钟）→-20℃（30分钟）→-80℃过夜→液氮保存，转移过程中需注意保冷，防止温度波动或冻存管融化。