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类器官-3D培养问与答
更新时间:2023-03-24 点击量:982

  类器官是能够在体外三维培养,并表现出相应器官生物学特征的“最小系统"。随着类器官培养技术的不断进步,应用也越来越广泛。关于类器官构建原理、培养等方面的问题解答,希望能够对各位小伙伴有所帮助。

 

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基础篇

Q1: 类器官培养对于起始细胞的来源有要求吗?

A1: 目前培养的类器官主要来源于上皮细胞,对于非上皮细胞来源的类器官培养方式还需要进一步研究。

 

Q2: 类器官按照起始细胞的类型,分为几种呢?

A2: 常见的类器官根据起始细胞的类型,可以分为两种:

(1)肿瘤组织来源的肿瘤类器官;

(2)干细胞来源的类器官,包括:多能性干细胞 (PSC) /成体干细胞 (ASC)以及诱导多能干细胞(iPSC)。

 

Q3: 类器官是由单一种类细胞组成的吗?

A3: 类器官并不是单一细胞组成的结构,而是由具有干细胞性质的起始细胞进行分裂和分化,并将多种类型的细胞自组装的结构,自组装后的形态和功能与体内相应器官相似。

 

Q4:在没有新鲜组织的情况下,可以用冻存组织提取的原代细胞进行3D培养吗?

A4:可以的。已有学者验证过,将人结肠癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌和肝癌的手术组织切碎后,以梯度降温的方式进行冷冻,最终在液氮中保存15-18个月后进行复苏和原代细胞提取,分别对细胞进行2D和3D培养,证实了冻存对于细胞活力和生长速度均无显著影响【1】

当然,由于组织来源不同、冻存条件不同,还需要大家根据实际情况进行验证,新鲜组织提取的细胞依然是3D培养的选择。

 

Q5:类器官可以像细胞一样进行冻存和复苏吗?

A5:类器官可以冻存,通常会在传代2-3次之后选择冻存。为了达到最佳的效果,可以选择类器官成熟(传代7-10次)后再进行冻存。

 

Q6:类器官的尺寸需要进行控制吗?

A6:是的,主要的原因是类器官内部缺乏循环系统。

当类器官的尺寸较大时,靠近中心的细胞难以和外界进行氧气和营养成分的交换。因此这个结构尺寸越大,死亡的细胞就越多(如图1)【2】。我们在培养的过程中,需要控制类器官的大小在4-5mm以内。未来的类器官技术可以与血管类器官结合在一起,建立一个功能性的封闭循环系统,用以培养出更大尺寸的类器官。

 

图1. TUNEL染色表明较大尺寸的类器官中心有大量细胞死亡(绿色),比例尺为100μm【2】

Q7:类器官传代的标准是什么?

A7:类器官的传代通常是根据培养的时间判断。一般在7-14天时进行第一次传代,后续则每7-10天传代一次【3】

Q8:类器官可以进行多少次传代?

A8:大部分类器官可以在体外连续传代10次(>6个月),甚至有些类器官可以连续传代20次(>12个月)并且维持原有的生长速度【4】

Q9: 鉴定类器官的方法有哪些?

A9: 初步可以通过显微镜和H&E染色观察形态;然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫荧光、流式细胞术检测该类器官是否表达相应的biomarker;基因测序可以鉴定所培养的类器官是否有某些特征丢失;对于部分类器官,还可以检测其是否具有功能,例如:已有研究检测出胃类器官可以分泌胃酸,心脏类器官可以自主跳动。

Q10: 类器官是如何按照我们的意愿进行定向分化的?

A10: 在进行类器官培养前,我们需要了解该器官在体内的发育过程,及早期发育相关的信号通路。

以胃类器官培养为例:胃由前后肠发育而来,早期发育需要由多种信号通路共同调控。那么在体外我们需要通过添加细胞因子的方式,指导激活/抑制相应的信号通路,来达到相同的效果,如:PSCs在Activin A的作用下分化为内胚层,Wnt3a、FGF-4和Noggin指导细胞向向前肠分化【5】

 

问:类器官原代培养的挺好的,一传代就不行了是什么原因?

答:可能是传代过程有样本的丢失,因为基质胶重选后还是会有一些类器官在胶里,传代的时候可以不用把基质胶wan全去除干净,留一点。

 

问:除了T细胞,类器官还可以和哪些细胞共培养?

答:还可以和PBMC、成纤维细胞共培养

 

问:类器官复苏的标准是什么?

答:类器官复苏后,培养1周左右,可以正常进行传代说明复苏效果比较好。

 

问:类器官冻存的标准是什么呢?冻存需要多少类器官?

答:前5代建议是取2-3孔冻存为1管,1孔大概是20个类器官左右。

 

问:类器官鉴定的方法有哪些?

答:鉴定方式一是可以从组织层面进行,主要是组化鉴定;另外是分子层面,可以进行外显子测序或者转录组测序等测序手段。

 

问:类器官培养成功的标准是什么呢?

答:目前还没用一个统一的标准,一般类器官可以稳定传代3代以上,说明干性是比较好的。

 

问:类器官长到多大可以做药筛呢?

答:一般传代后长到200-300um可以进行药筛实验

 

问:一个类器官试剂盒 可以养多少个类器官?

答:2-4个,100ml的培养基可以养200个孔。

 

问:类器官可以直接用细胞系培养吗?

答:用细胞系培养的不能成为类器官,只能称之为细胞球。

 

问:取材时为什么剔除脂肪组织?脂肪肝可以做类器官培养吗?

答:脂肪组织影响后续消化分离得到的干细胞纯度,脂肪肝也是可以做类器官培养的,消化前可以多清洗几次,去掉表面脂肪。

 

:类器官培养一定需要基质胶吗?

答:基质胶主要是为类器官提供支撑作用和营养物质,基质胶主要成分有laminin,collagen IV,heparan sulfate proteoglycans。

 

问:如果要做药筛需要额外去除基质胶和培养基吗?

答:和传代培养铺板一样,药用培养基稀释就可以。

 

问:类器官量多小的时候不需要加消化液?

答:一般是100um以下。

 

问: 想要CTC培养,需要多少样本量呢?

答:至少50+个CTC,取样时可以多取一些血,CTC细胞占比比较少。

 

问:原代培养中消化下来的细胞是只有干细胞吗?

答:消化下来的细胞包含各个种类的细胞,但是能培养成类器官的只有成体干细胞和肿瘤干细胞,没有干性的细胞在培养过程中不会增殖分化,养的过程会死掉。

 

问:初始量样本量10*5,活性大于90%,可以培养出多少类器官?

答:培养一代,一般是24孔板的10个孔。

 

问: 类器官培养一代需要多长时间?

:一般需要5-7天,长得快可3-5天。