类器官是能够在体外三维培养，并表现出相应器官生物学特征的“最小系统"。随着类器官培养技术的不断进步，应用也越来越广泛。关于类器官构建原理、培养等方面的问题解答，希望能够对各位小伙伴有所帮助。

基础篇

Q1: 类器官培养对于起始细胞的来源有要求吗？

A1: 目前培养的类器官主要来源于上皮细胞，对于非上皮细胞来源的类器官培养方式还需要进一步研究。

Q2: 类器官按照起始细胞的类型，分为几种呢？

A2: 常见的类器官根据起始细胞的类型，可以分为两种：

（1）肿瘤组织来源的肿瘤类器官；

（2）干细胞来源的类器官，包括：多能性干细胞 (PSC) /成体干细胞 (ASC)以及诱导多能干细胞(iPSC)。

Q3: 类器官是由单一种类细胞组成的吗？

A3: 类器官并不是单一细胞组成的结构，而是由具有干细胞性质的起始细胞进行分裂和分化，并将多种类型的细胞自组装的结构，自组装后的形态和功能与体内相应器官相似。

Q4：在没有新鲜组织的情况下，可以用冻存组织提取的原代细胞进行3D培养吗？

A4：可以的。已有学者验证过，将人结肠癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌和肝癌的手术组织切碎后，以梯度降温的方式进行冷冻，最终在液氮中保存15-18个月后进行复苏和原代细胞提取，分别对细胞进行2D和3D培养，证实了冻存对于细胞活力和生长速度均无显著影响^【1】。

当然，由于组织来源不同、冻存条件不同，还需要大家根据实际情况进行验证，新鲜组织提取的细胞依然是3D培养的选择。

Q5：类器官可以像细胞一样进行冻存和复苏吗？

A5：类器官可以冻存，通常会在传代2-3次之后选择冻存。为了达到最佳的效果，可以选择类器官成熟（传代7-10次）后再进行冻存。

Q6：类器官的尺寸需要进行控制吗？

A6：是的，主要的原因是类器官内部缺乏循环系统。

当类器官的尺寸较大时，靠近中心的细胞难以和外界进行氧气和营养成分的交换。因此这个结构尺寸越大，死亡的细胞就越多（如图1）^【2】。我们在培养的过程中，需要控制类器官的大小在4-5mm以内。未来的类器官技术可以与血管类器官结合在一起，建立一个功能性的封闭循环系统，用以培养出更大尺寸的类器官。

图1. TUNEL染色表明较大尺寸的类器官中心有大量细胞死亡（绿色），比例尺为100μm^【2】

Q7：类器官传代的标准是什么？

A7：类器官的传代通常是根据培养的时间判断。一般在7-14天时进行第一次传代，后续则每7-10天传代一次^【3】。

Q8：类器官可以进行多少次传代？

A8：大部分类器官可以在体外连续传代10次（>6个月），甚至有些类器官可以连续传代20次（>12个月）并且维持原有的生长速度^【4】。

Q9: 鉴定类器官的方法有哪些？

A9: 初步可以通过显微镜和H&E染色观察形态；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫荧光、流式细胞术检测该类器官是否表达相应的biomarker；基因测序可以鉴定所培养的类器官是否有某些特征丢失；对于部分类器官，还可以检测其是否具有功能，例如：已有研究检测出胃类器官可以分泌胃酸，心脏类器官可以自主跳动。

Q10: 类器官是如何按照我们的意愿进行定向分化的？

A10: 在进行类器官培养前，我们需要了解该器官在体内的发育过程，及早期发育相关的信号通路。

以胃类器官培养为例：胃由前后肠发育而来，早期发育需要由多种信号通路共同调控。那么在体外我们需要通过添加细胞因子的方式，指导激活/抑制相应的信号通路，来达到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化为内胚层，Wnt3a、FGF-4和Noggin指导细胞向向前肠分化^【5】。

问：类器官原代培养的挺好的，一传代就不行了是什么原因？

答：可能是传代过程有样本的丢失，因为基质胶重选后还是会有一些类器官在胶里，传代的时候可以不用把基质胶wan全去除干净，留一点。

问：除了T细胞，类器官还可以和哪些细胞共培养？

答：还可以和PBMC、成纤维细胞共培养

问：类器官复苏的标准是什么？

答：类器官复苏后，培养1周左右，可以正常进行传代说明复苏效果比较好。

问：类器官冻存的标准是什么呢？冻存需要多少类器官？

答：前5代建议是取2-3孔冻存为1管，1孔大概是20个类器官左右。

问：类器官鉴定的方法有哪些？

答：鉴定方式一是可以从组织层面进行，主要是组化鉴定；另外是分子层面，可以进行外显子测序或者转录组测序等测序手段。

问：类器官培养成功的标准是什么呢？

答：目前还没用一个统一的标准，一般类器官可以稳定传代3代以上，说明干性是比较好的。

问：类器官长到多大可以做药筛呢？

答：一般传代后长到200-300um可以进行药筛实验

问：一个类器官试剂盒 可以养多少个类器官？

答：2-4个，100ml的培养基可以养200个孔。

问：类器官可以直接用细胞系培养吗?

答：用细胞系培养的不能成为类器官，只能称之为细胞球。

问：取材时为什么剔除脂肪组织？脂肪肝可以做类器官培养吗？

答：脂肪组织影响后续消化分离得到的干细胞纯度，脂肪肝也是可以做类器官培养的，消化前可以多清洗几次，去掉表面脂肪。

问 ：类器官培养一定需要基质胶吗？

答：基质胶主要是为类器官提供支撑作用和营养物质，基质胶主要成分有laminin，collagen IV，heparan sulfate proteoglycans。

问：如果要做药筛需要额外去除基质胶和培养基吗？

答：和传代培养铺板一样，药用培养基稀释就可以。

问：类器官量多小的时候不需要加消化液？

答：一般是100um以下。

问： 想要CTC培养，需要多少样本量呢？

答：至少50+个CTC，取样时可以多取一些血，CTC细胞占比比较少。

问：原代培养中消化下来的细胞是只有干细胞吗？

答：消化下来的细胞包含各个种类的细胞，但是能培养成类器官的只有成体干细胞和肿瘤干细胞，没有干性的细胞在培养过程中不会增殖分化，养的过程会死掉。

问：初始量样本量10*5，活性大于90%，可以培养出多少类器官？

答：培养一代，一般是24孔板的10个孔。

问： 类器官培养一代需要多长时间？

答 ：一般需要5-7天，长得快可3-5天。