COLO320-GFP-puro(LV5-NC)细胞培养方法

简介：

产品名称：COLO320-GFP-puro(LV5-NC)

培养条件：1640+10%FBS+1%P/S

生长状态：贴壁+悬浮生长

支原体污染一直是细胞培养的“头号敌人"，但是支原体的存在却十分普遍，它的“不请自来"总是让我们措手不及。世界上有近60%的实验室正在遭受支原体污染的困扰，今天就让我们来好好认识这个“刺头"吧！

什么是支原体？

支原体结构简单，具有高度多形性、无细胞壁、增殖缓慢、可在人工培养基中存活并增殖的特点。除此之外，它的“个头"很小，只有0.1-0.3um，可通过一般的滤菌器。支原体主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成丝状后断裂呈球杆状颗粒。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，最适pH值为7.8～8.0。在固体培养基上培养时，形成典型的“荷包蛋"状菌落。

支原体是如何欺负细胞的？

我们知道一株被支原体污染的细胞是无法用来做实验得出准确的实验数据的--一方面是因为支原体本身也是一种原核细胞生物，相当于一种交叉污染；另一方面，细胞感染支原体后，由于支原体大量消耗培养基中的营养和细胞代谢的基础成分，包括核酸前体、氨基酸、维生素、脂质、胆固醇等，导致细胞增殖缓慢及各种代谢、功能紊乱甚至丧失；除此之外，支原体还会吸附在细胞表面，破坏细胞膜的完整性，更有少数类型支原体可进入细胞内，如发酵支原体、生殖支原体和肺炎支原体。

如何确诊细胞支原体污染？

支原体污染之所以让广大科研人员头疼，是因为它在普通光学显微镜下难以被发现，并且细胞被污染早期不会表现出明显的“症状"。

一般来说，如果培养过程中细胞增殖突然变慢，培养基中黑点、碎片明显增多，培养基PH变化（变黄）周期变短，那么细胞很可能已经感染了支原体。这时候，就需要使用各种检测手段来确认。目前常用的方法有：DNA染色法，支原体培养法，PCR法（包括凝胶电泳和荧光定量），化学发光法。前两种方法结果可靠，但实验周期长。PCR法原理是在支原体16S rRNA基因的保守区设计引物，通过检测支原体DNA来检测细胞中有无支原体的污染，得到的广泛应用。

细胞确诊支原体污染后，怎么办？

如果您的细胞不幸感染了支原体，好的处理方式是立即丢弃该细胞，并对培养箱、超净台等设施及场所进行消毒灭菌。因为支原体的传播非常隐秘，相关研究表明其甚至能通过气溶胶传播。当然，如果您的细胞非常珍贵或者不能再获得，可以尝试使用抑制支原体的药物进行处理，尝试消除支原体污染。能抑制支原体的药物有四环素；大环内酯类药物，如罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等；喹诺酮类药物，如氧氟沙星、司帕沙星等。

这个过程一般周期较长，因为使用药物处理时需配合多次大比例连续传代来提高成功率。坚持，就是胜利！

传代培养及其操作步骤

原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。

1、操作步骤：

（1）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。

（2）向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。

（3）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。

（4）吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。

（5）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。

（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。

（7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。

2、注意事项：

（1）掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。

（2）掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。

千舍生物热卖耐药细胞株：

人转移胰腺腺癌细胞吉西他滨耐药株AsPC-1/GEM DMEM+15%FBS+1%L-谷氨酰胺+1%P/S 贴壁生长

人结直肠癌氟尿嘧啶耐药株HCT15/Fu 1640+10%FBS+1%P/S +20ug/ml 5-FU 贴壁生长

人结直肠癌紫杉醇耐药株HCT-15/Taxol 1640+10%FBS+1%P/S+500ng/ml紫杉醇 贴壁生长

人结直肠癌细胞氟尿嘧啶耐药株LOVO/5FU F12K+10%FBS+1%P/S 贴壁生长

人乳腺癌阿霉素耐药细胞 MCF-7/Adr 1640+10%FBS+1%PS+500ng/mL ADR 贴壁生长

人结直肠癌细胞氟尿嘧啶耐药株 SW620/5FU L15+10%FBS +1%P/S   贴壁生长

人甲状腺癌细胞8305C（未分化） 8305C MEM+10%FBS+1%L-谷氨酰胺+1%NEAA+1%P/S  

人甲状腺癌细胞 BCPaP 1640+10%FBS+1%P/S

人甲状腺癌细胞 FTC-133 1640+10%FBS +1%P/S

人甲状腺乳头状癌细胞 IHH4 1640+10%FBS +1%P/S

人甲状腺癌细胞 KTC-1 1640+10%FBS+1%L-谷氨酰胺 +1%丙酮酸钠+NEAA+1%P/S

人甲状腺正常细胞 Nthy-ori 3-1 1640+10%FBS+1%P/S  

人甲状腺癌细胞 SW579 L15+10%FBS+1%P/S      

人乳头状甲状腺癌细胞株 TPC-1 1640+10%FBS+1%P/S

人甲状腺癌细胞 TT F-12K+10%FBS+1%P/S