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HepG2细胞培养攻略
发布时间:2022-09-13 点击量:137

HepG2细胞培养攻略

HepG2细胞来源于一个15岁白人的肝癌组织。该细胞分泌多种血浆蛋白:清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。该细胞能大容量培养,乙肝表面抗原阴性,对G418有抗性,对人生长激素有刺激反应。

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HepG2细胞广泛应用于遗传毒理学试验、外源性生物性异物的细胞毒性、乙型肝炎病毒感染机制、病毒培养等方面的研究。由于其与肝细胞具有相同的生物学活性,还被用于胰岛素抵抗的研究。

细胞名称:人肝癌细胞细胞简称:HepG2种属来源:人组织来源:肝疾病特征:肝癌细胞形态:上皮细胞样生长特性:贴壁生长培养体系:MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%NEAA+100mM Sodium Pyruvate+1%P/S传代比例:1:2-1:4,每2-3天换液一次传代周期:72-96 h培养条件:气相:95%空气+5%CO2,温度:37℃冻存条件:60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO,液氮储存传代:吸去培养液。用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次,以去除血清(血清会抑制胰酶的活性)。加2-3毫升Trypsin-EDTA,放在37℃培养箱内约5分钟,直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液,用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。(以1:4至1:6为宜,传代期间培养液每周更换2次)注释:该细胞表达3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶还原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。该细胞在有(英文名:gramoxone)的环境下过氧化氢酶mRNA表达增加,ApoA-I mRNA 表达减少。

HepG2细胞培养的*佳培养条件

HepG2细胞的复苏条件

1.1 复苏温度的选择

细胞复苏:快速将所冻存细胞40℃水浴摇床60转/ min慢摇至其溶解,溶解后马上转入 37 ℃水浴箱,手工慢摇恒温 2~3min复苏 ,复苏后 800 转/ min 离心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培养基 ,混匀后加入细胞培养板 ,每孔 1 ml,5%CO2温箱 37℃培养。与传统 37 ℃水浴方法复苏后细胞存活率为 68.4% 相比较,先40℃溶解后再37℃恒温方法复苏的细胞存活率为85.7%,优于传统方法。

1.2 复苏用培养基的选择使用RPMI-1640和DMEM两种培养基对HepG2细胞进行培养,结果发现,用DMEM培养基培养的细胞结果在接种密度为1×104/c㎡、血清含量为15%时,经6h培养后细胞开始贴壁,12h后大部分细胞贴壁,且增值速度最快,4d后可以按1:3的比例传代。而用RPMI-1640培养基培养的细胞在接种密度为1×104/c㎡、血清含量为20%时,经6h培养后细胞贴壁不明显,但12h后部分细胞贴壁,24h后亦大部分细胞贴壁,且增值速度相对较慢,5天后可以按1:3的比例进行传代。以上结果说明,使用DMEM培养基既可以节省血清,细胞贴壁所用时间短、增殖速度快,并且传代细胞培养也使用DMEM培养基,使用DMEM培养基进行复苏,避免了配制不同培养基所带来的麻烦,因此在HepG2细胞复苏中推荐使用DMEM培养基。
1.3 复苏时的接种密度研究发现当接种密度为1×104/cm2,血清含量为20%时, 细胞24h后大部分贴壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例传代;当接种密度大于1×104/c㎡和(或)血清含量少于20%时, 细胞表现为贴壁困难, 出现进行性退化; 当接种密度小于1×104/c㎡ 血清含量为20%时, 细胞24h后大部分贴壁, 但增殖速度明显减慢, 约7d后才可按1:3比例传代。

消化酶及消化时间的选择

如果用EDTA+胰酶的消化能力太强,消化时间不好把握,传代消化后细胞死亡较多;单用EDTA消化能力太弱,消化时间太长且不易将细胞消化完全;用PBS将细胞洗3次,再加入 0.25%胰酶,覆盖细胞约30s后吸去胰酶,37℃放置 2~3 min,显微镜下可观察到细胞消化适度。将待传代细胞不用PBS洗涤和用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后分别用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化(消化液用量为盖满瓶底),观察时间为30秒、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟。

结果发现:不用PBS洗涤的细胞分别用上述两种酶消化,10分钟后细胞仍然消化不完全。用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后的细胞,再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化时,分别经3分钟、1分钟和0.5分钟能完全消化好细胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化时,完全消化好细胞约需3分钟、1.5分钟、1分钟。二者的结果相符。

根据上述结果可知,在进行HepG2细胞的消化时,先用pH7.2的PBS洗涤三遍后,再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分钟效果比较好。

另一种推荐使用的消化方法如下:用1×PBS将细胞洗涤2次 再加入适量的0.15%胰蛋白酶(含有0.02%EDTA并以7:3的体积比混合)覆盖细胞约20秒后吸去胰蛋白酶 (含有0.02%EDTA并以7:3的体积比混合)。

 

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