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体内细胞培养及操作步骤
发布时间:2022-09-13 点击量:524

内细胞培养及操作步骤

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1、瘤细胞悬液接种

(1)无菌选取生长良好(有光泽,淡红色)瘤组织或对数生长期培养瘤细胞。


(2)在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨,经80~100目筛网过滤成细胞悬液。


(3)培养细胞应用PBS洗两遍。


(4)计数并调整细胞浓度至107~108/ml。


(5)常规消毒后,于接种部位(通常为背部或腋窝腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液(0.1ml/部位,>106细胞)。初次接种成功率低,细胞数尽可能多一些。


(6)次日注意观察动物一般情况。初次接种一般有一段较长的潜伏期,以后随着传代潜伏期逐渐缩短,最后固定为一个相对稳定的时间。

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2、腹水瘤的建立与腹水瘤的接种 将实体瘤细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位,引起腹水,腹水中含有瘤细胞,将这种腹水反复传代,即可成为腹水瘤。初次传代时,腹水常呈血性(含大量红细胞),反复传代后腹水逐渐变成乳白色。腹水瘤的接种过程如下。

(1)将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤,进行细胞计数。


(2)消毒动物,左下腹穿刺接种106腹水瘤细胞。


(3)接种腹水瘤细胞后约7~12d,待小鼠腹部明显膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部,用9号针头抽取腹水,也可行腹部解剖后,用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。


(4)抽取的腹水经3000rpm离心15min,收集上清,分装冻存备用。

四、培养细胞的冻存及复苏

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原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后,经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群,使之在体外模拟人体生理环境,在无菌、适当温度和一定的营养条件下,生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分,生长缓慢,但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验,如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。

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1、冻存细胞:

(1)选对数增生期细胞(证明无支原体污染),在冻存前1d换液。


(2)按常规方法把培养细胞制备成悬液,计数,使细胞密度达5×107/ml左右密度,离心,去上清。


(3)加入配制好的冻存液(培养液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲基亚砜(DMSO) 或甘油,可使冰点降低,使细胞内水分在冻结前透出细胞外。


(4)分装于无菌冻存管中,每管加1.5m悬液。


(5)旋好冻存管并仔细检查,一定要盖紧,做好标记。


(6)冻存:在特殊的仪器或简易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min时间内,下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度,过快能影响细胞内水分透出,太慢则促进冰晶形成。


操作时应戴防护眼镜和手套,以免液氮冻伤。

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2、复苏细胞:

(1)从罐中取出冻存管。


(2)迅速放入36℃~37℃水浴,不时摇动,使其急速融化,30~60s内完成。


(3)冻存管用70%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10ml培养液。


(4)低速离心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培养液洗一次。


(5)用培养液适当稀释后,装入培养瓶37℃培养,次日更换一次培养液后,继续培养。以后仍按常规进行培养。


冻存细胞数量要充分,密度应达到107/ml,在融后稀释20倍时,仍能保持5×105/ml数量。



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