可以这样说，对于需要消化传代的细胞，每一次的消化都是对这个细胞存活与否，状态好与不好最至关重要的考验。

在消化的过程中，你加入胰酶后，所有细胞都在被胰酶消化着，但是我们忽视了一个问题。细胞的生长状态是不一样的，每一个细胞的贴壁情况也是不一样的。我后来对消化的方法进行了改良，我称之为「四步消化法」。以难消化细胞为例，具体操作如下：

首先不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗 1-2 遍，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。

然后再加入少量新培养基直接吹打一遍，这一遍是把贴壁不牢固的细胞吹打下来。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶。你可以将这些传入新瓶培养，以与后面胰酶消化过的细胞对比观察看谁长的更好一点就知道该细胞对胰酶的敏感度。

吸干净瓶内剩余液体，加入 0.3 ml 左右的胰酶润洗一遍，吸掉弃之，再加入 1 ml 左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶与干净里备用，加入新培养基开始吹打，吹打 2-3 遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用 2 ml 左右新培养基洗一遍与前面的混合。你也可以传入新瓶培养，以与后面及前面的做对比。

然后把前面刚吸出来的胰酶重新加进瓶里，继续消化剩余的贴壁牢固的细胞。当然你也可以用新的胰酶。继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打。悬液传入新瓶培养，根据你实际情况自己把握。

其实还可以有第五步，对于特别难消化的细胞和对胰酶特别敏感的细胞的话，你可以继续加第五步甚至第六步。为了细胞更好的状态，更漂亮的样子，没办法，你必须分多批多次消化，这样才能最大限度地将胰酶对细胞的损伤降到低，保证细胞的状态能够优。

当然了，如果细胞是属于那种很容易消化的细胞，像 RAW264.7，仅仅第二步就搞定。就没必要第三步第四步了。这个需要你在实验中自己用心去体会。建议你接受一个新细胞时把各步消化的细胞分别培养起来做比较，去摸索好细胞对胰酶的要求。便于你后续实验的开展。

将细胞消化分成这几步，除了是为了避免胰酶对细胞的损伤之外，还有一个更重要的作用就是，可以程度地把细胞吹打成单个单个的状态，不成片不连体。

因为细胞生长的时候肯定是要相互联系，大部分的细胞都是要成片生长的，尤其是对于贴壁细胞，单个细胞贴壁之后长着长着就长到一片去了。但是如果是成片的细胞抱团的话，传代后细胞是不能贴壁的，这样抱团的细胞就会死亡。所以，消化传代的时候一定要将细胞消化成单个的独立状态，这个非常考究你的功夫。

细胞一旦脱落入悬液里，你很难再将他吹打成单个。所以必须要在细胞未脱落之前将其吹打开，受力点就是细胞贴壁的地方。既要消化到容易吹打下来，又不能太过，一吹就整片脱落，要单个单个地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是为了保证不同生长状态贴壁程度的细胞能够都维持在好的受力点分散开。这个是很重要的一点。

另外关于传代很重要一点就是，一定不能等到细胞长满的时候才去消化传代。要在细胞长到 70% 左右的时候就要传代了，一旦发现细胞生长中已经有叠层生长的时候就要立即进行消化传代。不能再拖了。

千舍生物部分细胞*：

5637 人膀胱癌细胞

293T 人肾细胞

3T3-L1  小鼠胚胎成纤维细胞(前脂肪)

786-O   人肾透明细胞腺癌细胞

A375 人恶性黑色素瘤细胞

A431 人表皮癌细胞

A549 人肺腺癌细胞

AAV-293 人胚肾细胞

ARPE-19 人视网膜上皮细胞

AsPC-1 胰腺导管腺癌

AV3 人宫颈癌细胞

B16 小鼠黑色素瘤细胞

BCPAP 人甲状腺癌乳头状细胞

Bend.3 小鼠脑微血管内皮细胞

BT-474 人乳腺导管癌细胞

BT-B 人膀胱癌细胞

BV-2 小鼠小胶质瘤细胞

C6 大鼠胶质瘤细胞

CaCO2 人结直肠腺癌细胞

CALU-6 人肺腺癌细胞

chang liver 人张氏肝细胞/人乳头瘤病毒相关的子宫颈腺癌细胞

CHO-K1 中国仓鼠卵巢细胞系

COLO320 人结肠癌细胞

COLO320-GFP-puro(GHRLOS过表达)

COLO320-GFP-puro(LV5-NC)

COS-7 非洲绿猴肾细胞

CT26.wt       小鼠结肠癌细胞

DAMI 人巨核细胞白血病细胞

DC2.4 小鼠树突状细胞

DF-1 鸡胚成纤维细胞系

DU145    人前列腺癌细胞

ECV-304 人脐静脉内皮细胞株

EH-GB1 首株来源于转移灶的人胆囊癌细胞系

FaDu 人咽鳞癌细胞

GBC-SD 人胆囊癌细胞系

GH3 大鼠垂体瘤细胞

GT1.1 小鼠垂体瘤细胞

H446 人非小细胞肺癌细胞

H9C2（2-1） 大鼠心肌细胞

HaCaT 人永生化表皮细胞

HCC15 鳞状细胞肺癌

HCCLM3 人高转移肝癌细胞

HCT116 人结肠癌细胞

HCT-116/L-OHP 人结肠癌奥沙利铂耐药细胞

HCT-8 人结肠癌细胞

HDF 人真皮成纤维细胞

HEL    人红白细胞白血病细胞

HELA 人宫颈癌癌细胞

HELA-LUCI Luciferase稳定表达Hela细胞

HEPG2 人肝癌细胞

HFF-1 人包皮成纤维细胞

HGC-27 人胃癌细胞(未分化)

HK-2 人肾小管上皮细胞

HO8910PM 人高转移卵巢浆液性囊腺癌细胞

Hs578T 人乳腺癌细胞（浸润性导管癌）

HT-29   人结肠癌细胞

HUCCT1 人胆管细胞癌

I Shikawa 人子宫内膜癌细胞

J774A.1 小鼠单核巨噬细胞

J82    人膀胱癌细胞

K562 慢性粒细胞白血病细胞

KYSE150 人食管鳞癌细胞

L02 人正常肝细胞

L6 大鼠成肌细胞

L929 小鼠成纤维细胞

LLC 小鼠 Lewis(肺癌细胞)

LOVO 人结直肠癌细胞

LX-2 人肝星状细胞

MC3T3-E1 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞

MCF-10A 人正常乳腺细胞

MDA-MB-231 乳腺癌细胞

MDBK 牛肾细胞

MDCK 狗肾转化细胞

MG63 人成骨肉瘤细胞

MIA PaCa-2 胰腺癌细胞系

MKN28 人胃癌细胞

MKN45 人胃癌细胞

MKN74 人胃癌细胞

mMSC 小鼠间充质干细胞

MOLT4 成人T急性淋巴细胞白血病细胞

NCI-H1650 微创肺腺癌细胞

NCI-H1975 人非小细胞肺腺癌细胞

NCI-H460     大细胞肺癌细胞

NIH-3T3 小鼠胚胎成纤维细胞

OVCAR-3 人卵巢癌细胞

OVCAR-8 高级别卵巢浆液性腺癌细胞

P53R(JHU-56) 人结直肠癌细胞

PANC-1    人胰腺癌细胞

PANC-1 GFP-NC 人胰腺癌细胞 带绿色荧光

PANC-1 TRPM2-siRNA 人胰腺癌细胞 TRPM2基因抑制

PA-TU-8988T 人胰腺细胞

PC-12（低分化） 大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株

PC-12(高分化)   大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株

PECA 小鼠皮肤鳞状细胞癌

PH 成人急性单核细胞白血病

PK-15 猪肾细胞

Raji 人B淋巴瘤细胞

RAW264.7   小鼠单核细胞

RSC96 大鼠雪旺细胞

Saos-2 人成骨肉瘤细胞

SCL-1 人皮肤鳞癌细胞

SK-BR-3 人乳腺癌传代细胞

SK-OV-3 人卵巢癌细胞

SMMC-7721 人肝癌细胞

SNU-899 上呼吸消化道鳞状细胞癌

SPEC-2 子宫内膜浆液性表面乳头状癌细胞

ST 猪胎睾丸细胞

SU-DHL-6 弥漫性大B细胞淋巴瘤生发中心B细胞型

SV40 MES 13 小鼠肾小球系膜细胞

SV-HUC-1 人正常膀胱上皮细胞

SW480   人结直肠癌细胞

SW620 人结肠腺癌细胞

SW900 肺鳞状细胞癌

T24   人膀胱移行细胞癌细胞

TE-1 人食管癌细胞

THP-1 人急性单核细胞白血病单核细胞株

TM3 小鼠睾丸间质细胞

TPC-1 人甲状腺乳头状癌的细胞系

U118MG 人星形胶质细胞

U266 人骨髓瘤细胞

U87MG  人脑星形胶质母细胞瘤

WiDr 人大肠癌细胞

Yac-1 小鼠淋巴瘤细胞

山羊MSC细胞 山羊骨髓间充质干细胞

山羊关节软骨细胞