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免疫荧光单标记和双标记的方法?及千舍热卖细胞?
发布时间:2022-08-18 点击量:168

免疫荧光单标记和双标记的方法

1. 免疫荧光单标记方法

免疫 荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子,方法比较简单,只要按照染色步骤去做,通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择,固定液选择的合适与否,可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。

1)所需材料与试剂

(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%一70%的细胞。

(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。

(3)4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。

(4)封闭液。

(5)0.01mol/LPBS缓冲液。

2)染色方法

(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass―bottom培养皿,用0.01MPBS洗2―3遍

(2)加入0.3%的TritonX―100,37℃,30rain。

(3)加入4%多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。

(4)正常阻断血清1:20封闭室温20~30min,抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。

(5)去掉正常血清,直接加入一抗,37C孵育1h或4℃过夜。抗体以0.01mol/LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。

(6)0.3%TritonX―100洗5min,0.01mol/IPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01MPBS洗5rain。

 (7)加入FITC―二抗或TRITC―二抗,37℃,孵育1h。

(8)0.3%TritonX―100洗5rain,0.01mol/LPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01mol/LPBS洗5mln,用滤纸吸干。

 (9)90%甘油(PBS配制)封片。

(10)激光扫描共焦显微镜下观察,或于4℃避光保存。

 2.免疫荧光双标记方法

免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子,当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些,首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如:A抗体为多克隆抗体,来自家兔;B抗体为单克隆抗体,来自小鼠)。其次,两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠,且尽量远离,通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下,染色时两种一抗可以同时孵育,然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱,而另一种颜色比较强时,应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。

3,样品制备注意事项

(1)在进行免疫荧光标记时,如样品的来源为组织,应采用冷冻切片。

(2)样品制备应满足一般荧光显微镜观察的要求

(3)尽量去除非特异性荧光信号。细胞经荧光染色后可能会产生自发荧光,可用PBS取代一抗作为对照,以区分自发荧光和阳性结果。

 (4)为了不将细胞压扁,盖玻片与载玻片之间的介质多用甘油与PBS混合液(9:1)封片,甘油还有抗荧光淬灭的作用。同时还应注意封片时避免产生气泡。

 (5)用指甲油将盖玻片四周封片,注意避免将细胞压扁。

 (6)为防止荧光淬灭,可在介质中加入抗氧化剂DABCO(100mg/mi),室温,密封可保存6个月;或苯二胺(100mg/mi),-20℃,保存2~3周。

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