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“外泌体”的常见问题集锦~
发布时间:2022-03-25 点击量:585

如何鉴定提取出来的外泌体?

以目前外泌体的分离手段很难获得十分纯净而且单一的外泌体样品,也没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。根据国际细胞外囊泡协会发表的指导手册《MISEV 2018》,外泌体特征鉴定通过NTA测粒径分布、TEM电镜分析形态、WB检测标志蛋白三项来验证。NTA分析样品中外泌体的粒径分布和颗粒浓度,TEM电子显微镜来观察样品中外泌体的形态特征,WB检测外泌体标志蛋白。

外泌体如何保存?


不同时间、温度的保存对不同的外泌体样本影响不一;如果研究方向为外泌体形态特征、蛋白或其他功能性分析,在分离后新鲜使用为最佳。目前主流的建议是提取出外泌体后最好是新鲜使用,或低温短期保存。

短时间几天内可以放4°C,长时间储存置于-80°C保存。

NTA检测可以进行外泌体定量吗?

NTA是物理方法,基于颗粒的布朗运动,因为不管是脂质体、蛋白,甚至是PBS中的颗粒(部分实验室自行配置的PBS中发现大量颗粒,推荐在外泌体研究中,用VC品牌的PBS(P/N:C3580-0500),避免干扰),都会被软件读取,并不能分辨是否为外泌体。但NTA提供的粒径分布可供判断所提取的内含物是否在外泌体的粒径范围内;另外,在做外泌体分泌的对比实验中,NTA提供的浓度值也可以作为重要的参考数据。

外泌体NTA检测需要多少量?

Zetaview仪器的最佳检测区间是10^7 particles/ml,且有浓度检测下限,为10^5 particles/ml,一般进样量不少于2 ml;

无法准确建议送样量,检测需要量与样本本身浓度有关,样本浓,则用量小,反之则多,根据检测经验,样本取用量一般在2 µl-100 µl不等,取用量大于50 µl时大多由于样本分泌量过低、提取失败或者对样本有过多稀释。

一般建议:送样量不低于30 µl。

外泌体用什么分离方法比较好?

无法明确哪种分离方法比较好,各有千秋,以下列出常用的外泌体分离方法:

超速离心法(差速离心和密度梯度离心):操作繁琐,耗时长,分离外泌体纯度较高,但得率低,目前分离外泌体主流方法;

尺寸排阻色谱(Size-exclusion chromatography,SEC):应用填充多孔聚合物微球的柱子,精确分离大小分子,操作简便,耗时短,分离外泌体纯度较高;

聚合物沉淀法:操作简便,耗时短,可能会同时分离非囊泡污染物(包括脂蛋白),分离外泌体纯度较低;

磁珠免疫法:通过特定的抗体组合从样本中捕获不同类型的外泌体,免疫亲和技术具有高特异性、可获得高纯度的外泌体、且不影响外泌体形态完整等优点,是富集表征*的外泌体的优选方法。但是此方法效率低,外泌体内含物的生物活性易受pH和盐浓度影响,不利于下游实验的进行。

 

组合方法:如聚合物沉淀法+SEC (CellGS Exo-spin 外泌体纯化试剂盒)纯化流程温和,无需高速离心,操作简便并且产物纯度高,分离出的外泌体完好无缺,适用于下游功能研究、WB验证、RNA分析等。

 


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