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27个细胞传代培养常见问题
发布时间:2021-11-09 点击量:113


1、一般拿到细胞后,应该注意什么?

收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒,放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时的培养基拍一张照片,观察培养基的颜色和是否有漏液情况,显微镜下拍细胞100X,200X各两张),排除细胞本身污染的情况。


2、何时须更换培养基?

视细胞生长密度而定,常规细胞2-3天更换培养基。


3、细胞何时进行传代较好?

一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代,所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了),但有接触抑制的细胞,在汇合前就必须进行传代,这类细胞一般在密度70-80%就进行传代,否则会引起细胞分化。


4、贴壁细胞如何进行传代?

去掉原T25培养瓶里面的培养基,T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS,再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞,显微镜下观察,待细胞变圆,细胞间隙明显,部分细胞刚开始脱离瓶壁,加4 ml左右完全培养液混匀终止消化,将细胞小心吹打下来,1000 rpm/min室温离心5min;弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3,1:3-1:6,1:6-1:8),每T25瓶补足培养基至5-6 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。

 


5、悬浮性细胞应如何传代处理?

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,将细胞悬液移入离心管中,1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8),每T25瓶加完全培养液至4-5 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长,此时细胞生长状态良好,当补液时,需避免反复吹打。


6、贴壁细胞传代如何使用胰酶?

一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时,易造成培养基中细胞碎片增多,黑渣子增多,常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化,对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化,细胞密度过高超过80%时,采用分步消化法。胰酶储存在–20°C,解冻在4°C进行,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会。


7、如何控制胰酶消化时间?

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤:消化过度细胞碎片增多,黑渣子增多,细胞会成片脱落,严重影响细胞活性,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。

 

不同细胞对消化液的敏感性不同,胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度,是否含EDTA,胰酶的储存时间,胰酶的储存温度,是否反复冻融,消化加入的胰酶体积,消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞,建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间,可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆,记录最佳消化时间,下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。


8、细胞离心下来的离心速率应为多少?

细胞传代或冻存时欲回收细胞,其离心速度一般为800-1000 rpm/min,室温离心5-8分钟,转速过高,将造成细胞破裂死亡。


9、如何区分活细胞和死细胞?

显微镜下观察:活细胞中间透亮,饱满,有光泽,死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。


10、如何用台盼兰计数活细胞?

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000 个/毫升,在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞,注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的,可直接用计数仪进行。


11、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。

 


12、使用胰蛋白酶加入EDTA是为什么?

EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。


13、可否使用与原先不同的培养基?

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,易造成细胞状态不好,最终造成细胞无法存活。


14、可否使用与原先不同的血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生很大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。


15、细胞为何生长不均匀?

细胞传代后放入培养箱没有摇匀,或者放入时摇匀,但在细胞贴壁前,又移动了培养瓶,频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少,培养箱搁板表面不平整,这些因素会导致细胞生长不均匀。


16、购买的细胞死亡或细胞存活率不佳

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。运输过程对细胞有严重影响。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。


17、细胞抱团怎么处理?

一些悬浮细胞抱团生长是正常现象,大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下,很可能会出现部分细胞抱团生长的现象,聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物,殃及周围的悬浮细胞,因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团,可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团,也可以尝试一下方法:将细胞悬液收集到15 ml离心管中,静置20 min左右,小心取上层细胞上清培养(该方法只能去除部分较大的细胞团)。


18、细胞内有空泡,是否是正常现象?

部分细胞本身存在一定的空泡(如HepG2,Ishikawa及一些耐药株等),这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡,则很可能是细胞状态不佳,可以通过调整血清浓度,控制消化,控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态;如果大部分细胞出现空泡,且单个细胞内空泡数目偏多,则可能细胞代次较高,细胞老化所致,需更换代次较早的细胞。


19、细胞传两代后开始逐渐死亡的原因

很可能是培养体系不适合细胞(未使用推荐的培养体系);或者消化过度,对细胞有严重影响;或者是传代比例不合适(具有密度依赖性的细胞,传代太稀;或者生长较快的细胞,传代较密,细胞严重堆叠生长)。


20、细胞生长逐渐变慢是什么原因?

细胞增殖变慢有以下原因:1. 消化过度 2. 传代过密 3.细胞营养不良 4.细胞频繁传代 5.细胞状态不佳或老化 6.细胞存在污染。


21、培养细胞时应使用5%或10%CO2?

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时,细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时,则应使用5% CO2培养细胞。


22、CO2培养箱之水盘如何保持清洁?

定期(每周一次)更换水盘里面的水,水盘的水必须使用无菌蒸馏水或无菌去离子,水盘中可添加1%硫酸铜以预防霉菌污染。


23、细胞接种密度多少合适?

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的一个重要原因。按照我们的经验:一般倍增时间24 h内的细胞,传代比率1:6-1:12为宜,倍增时间24-48 h的细胞,传代比率1:3-1:8为宜,倍增时间超过48h的细胞, 传代比率1:2-1:4为宜。


24、培养中常出现一些黑点,是污染吗?

首先肉眼观察培养液是否变浑浊,如果变浑浊,基本可以确定是污染;如果肉眼观察培养液没有变浑浊:在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则,是否运动,是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则,做布朗运动,黑点可能是细胞碎片(可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的),也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的,也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致,快速移动,很可能是细菌污染。


25、如何预防细胞培养中黑点的产生?

掌握细胞传代的最佳时机,不要细胞长老了再传代;掌握好消化时间,防止消化过度产生细胞碎片;减少血清等试剂的冻融次数;将培养液的PH调到最佳;严格控制水质和器皿的清洁。


26、黑点已经产生了,如何进行处理?

如果判定黑点是污染,请及时将细胞处理后丢弃。其他情况,可参照以下进行:

如果是悬浮细胞:收集细胞上清慢速离心(500-600 rpm/min,5-6 min)并更换新的培养瓶;如果是贴壁细胞:将细胞用PBS洗2-3遍,洗的时候,轻轻拍打培养瓶,让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落,再弃去PBS,消化时先加低浓度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右,让细胞间隙中的颗粒和碎片脱落下来,去掉低浓度胰酶,然后正常消化细胞,将收集的细胞悬液慢速离心(500-600 rpm/min,5-6 min)并更换新的培养瓶,并可以尝试适当增加血清浓度进行培养。


27、培养用dish,flask是否相同?

不同厂牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。

 

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