苏州千舍生物教你如何挽救细胞污染

以自建细胞系(laryngeal squamous carcinoma-1，LSC-1)第12代的某一被细菌污染的细胞株采取救治，比较效果并分析细胞生物学特性。

一、实验方法

1、抗生素法：

细菌培养：用无抗生素*培养液培养细胞3 d，收集上清离心后将沉淀物接种于血琼脂培养基，35e培养。

所采用的抗生素包括临床常用的15种抗生素，抗生素zui适抑菌浓度筛选:根据细菌药敏实验结果选出敏感抗生素，每种抗生素从zui低抑菌浓度MIC到zui高耐药浓度分别配制6个浓度梯度。将LSC-1细胞按1*104/孔种96孔板，细胞贴壁后加入含敏感抗生素的*培养液，24 h后换无抗生素培养液培养1 d，如此重复3次，连续7 d。

2、抗生素联合巨噬细胞吞噬法:

将上述抗生素处理过的细胞再用小鼠的巨噬细胞处理。巨噬细胞的制备:将灭菌的玻璃粉与0. 9%氯化钠注射液混和注入小鼠腹腔， 3 d后脱颈处死动物，无菌操作取小鼠腹腔液，离心收集巨噬细胞，与LSC-1细胞混合培养， 3 d后换液，弃去巨噬细胞。间隔一周后再用巨噬细胞共培养一次。

3、裸鼠体内接种法:

将LSC-1细胞按1*106个/mL接种裸鼠腋下皮下，连续观察，当肿物长至约1cm3后，脱颈处死动物，无菌操作取出肿物，采取组织块法做组织细胞培养。

二、效果鉴定

1、免疫组织化学鉴定

将上述3种方法处理的LSC-1细胞种植在直径为15 mm的无菌圆形盖玻片上，贴壁后做角蛋白AE1 /AE3免疫组化染色、HE染色

2、细胞周期鉴定

采用流式细胞仪测量碘化丙啶标记细胞的荧光强度，分析DNA含量。测试3种方法处理的LSC-1细胞周期，并与该细胞建系初期的第3代细胞状况做比对。

3、抗生素撤离观察

用无抗生素的*培养基培养3种方法处理的细胞，连续观察3周，取细胞上清做细菌培养。

Hyclone胎牛血清SH30084.03

Hyclone胎牛血清SH30406.02

Hyclone胎牛血清SH30406.05

Hyclone胎牛血清SH30396.03

Hyclone胎牛血清SH30070.03

特级胎牛血清 SH30070.03E

Hyclone胎牛血清 SH30370.03

活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03

活性炭/葡聚糖处理胎牛血清，热灭活 SH30068.03HI

马血清SH30074.03

乌拉圭胎牛血清 SV30087. 03

Hyclone胎牛血清SH30071.03

Hyclone胎牛血清SV30160.03

BOVOGEN胎牛血清 SFBS

BOVOGEN新生牛血清 SNCS

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101

PAA 优等胎牛血清FBS A15-151

BI优等胎牛血清 04-001-1ACS

BI ES级别胎牛血清 04-002-1A

BI 间充质胎牛血清 04-400-1A

Corning胎牛血清 35-076-CV

PAN胎牛血清FBS P30-3302

PAN胎牛血清FBS ST30-3302

PAN ES级别胎牛血清 ST30-2602

PAN胎牛血清Plus ST30-3302P

NTC优等胎牛血清 SFBE

Gemini优等胎牛血清 900-108

Gemini特级胎牛血清 100-500

Gemini科研用人AB血清100-512

TCB胎牛血清 101ZC

Sigma 特级胎牛血清F2442

Sigma正常人AB血清 H4522

SBI 无外泌体血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒装A31608-02、马血清16050-122

双抗15140-122、SV30010

胰酶 25200-056、SH30042.01

GIBCO 胰酶 25200-072

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐药株

HCT8/5-fu 人回肠直肠腺癌细胞五氟尿嘧啶耐药株

LOVO/5-FU 人结肠癌细胞五氟尿嘧啶耐药株

HCT116/L人结肠癌奥沙利铂耐药细胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病细胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌细胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人结肠癌细胞阿霉素耐药株

HNE1/DDP人鼻咽癌细胞顺铂耐药株

SGC7901/5-fu人胃癌细胞五氟尿嘧啶耐药株

A549/DDP人肺癌细胞顺铂耐药株

MCF-7/DDP人乳腺癌细胞顺铂耐药株

A549/ADR人肺癌细胞阿霉素耐药株

SGC7901/DDP人胃癌细胞顺铂耐药株

SKOV3/DDP人卵巢癌细胞顺铂耐药株

HELA/DDP人宫颈癌耐顺铂细胞株

NCI-H1650 人肺支气管癌细胞

RT4 人膀胱移行细胞乳头瘤

SK-N-MC 人神经上皮瘤细胞

SK-N-SH 人神经母细胞瘤细胞

SW982 人滑膜肉瘤细胞

T98G 人胶质母细胞瘤

U251MG(KO) 人类星形胶质细胞瘤细胞

U266 人骨髓瘤细胞

VCAP 人前列腺癌细胞

hTERT-HPNE 人胰腺导管细胞

ES-2 人卵巢透明细胞癌细胞

NCI-H1650人非小细胞肺癌细胞

H460 人大细胞肺癌细胞

HACAT 人永生化角质形成细胞

HCT116 人结肠癌细胞

HEK293 人胚肾细胞

HEPG2 人肝癌细胞

HGC27 人胃癌细胞(未分化)

HT-29 人结肠癌细胞

HUVEC 人脐静脉内皮细胞

KYSE150人食道癌细胞

L02(HL7702)人正常肝细胞  

LOVO 人结肠癌细胞

MCF-10A人正常乳腺上皮细胞

MCF7人乳腺癌细胞

LX-2 人肝星状细胞

MDA-MB-468人乳腺癌细胞

三、细胞系的维持、冻存与复苏:

将无抗生素培养3周的细胞按常规方法冻存，并于1个月后复苏，观察细胞生长状态。

四、结果

自建人喉癌细胞系LSC-1传至第12代以后，细胞生长速度变慢，已贴壁细胞变圆、漂起、死亡，细胞间隙出现可运动的微小生物，但培养液依然清亮不浑浊，收取上清液离心，将沉淀物行常规血琼脂培养， 24 h结果为无菌生长，培养5~7 d后开始出现灰白色细小菌落，光滑湿润，有透明溶血环，全自动细菌鉴定仪生化鉴定条检测为嗜麦芽寡养食单胞菌，该菌为非发酵革兰阴性杆菌。细菌药敏结果:在15种抗生素中，该菌仅对头孢他啶、哌啦西林、头孢哌酮/舒巴坦3种药物敏感，其余均耐药。

4.1 抗生素法除菌效果

经筛选， LSC-1细胞可耐受的抗生素zui佳抑菌浓度分别为:哌啦西林64 mg /L、头孢他啶2 mg /L、头孢哌酮/舒巴坦32 mg /L。LSC-1细胞在哌啦西林和头孢他啶zui佳抑菌浓度中分别传代一次，在头孢哌酮/舒巴坦中传代3次，并每种细胞各冻存3株。复苏情况:哌啦西林3株均未贴壁，头孢他啶两株复苏后贴壁，但生长一周后均出现细菌，细胞死亡;另一株第二次冻存，再次复苏后生长良好，但抗生素撤离后出现细菌，经鉴定仍为嗜麦芽寡养食单胞菌。头孢哌酮/舒巴坦3株复苏后均能存活，但生长缓慢，一周传代一次，仍有少量细菌，抗生素撤离后重又出现细菌污染。在3种抗生素中，头孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和细胞生长状态zui好，头孢他啶对细胞损伤较大，细胞表面粗糙，状态较差。

4.2 抗生素联合巨噬细胞吞噬法除菌效果

比较头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞先后使用和二者交替使用的除菌效果，并观察细胞冻存复苏后的传代次数，具体方法为:头孢哌酮/舒巴坦32 mg /L培养1次、2次、4次后，再分别与巨噬细胞共培养2次，各冻存1株;头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞交替培养3次，冻存1株。复苏后细胞状态:头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞依次使用者中，抗生素使用次数较多的细胞传代次数较多(5代);二者交替使用的细胞状态更好于前3株细胞，且传代次数也zui多(6代)。然而所有细胞zui终因状态不佳或污染重现而死亡。

4.3裸鼠体内接种法除菌效果

肿瘤细胞接种裸鼠体内40 d后开始出现肿块， 60d长至1 cm3左右。处死动物取出肿物，瘤体质量0. 39 g，体积为0. 8 cm*0. 6 cm*0. 4 cm。将组织块培养于含三抗的*培养基， 14 d后改用无抗生素培养，持续培养3周，细胞生长良好。之后自然传代8次，冻存1个月后复苏，细胞仍能贴壁生长。取上清液做细菌培养，结果为无菌生长。

五、 细胞形态及生物学特性

抗生素处理及裸鼠接种后的LSC-1细胞形态与LSC-1第三代基本相同，细胞呈多边形，有铺路石感。

免疫组织化学细胞角蛋白染色，裸鼠接种后的和抗生素处理的细胞均有AE1 /AE3阳性表达，但前者阳性比例(图1H)与第三代细胞(图1G)接近，后者阳性表达较少。

HE染色，接种裸鼠的LSC-1细胞具有高度的异型性:细胞形态及大小不等;核呈多形性:大小、形态及染色各异，胞核与胞质比例增大(接近1B1)，核仁粗大，数目增多，核分裂象增多，出现不对称、多极性等病理性核分裂，偶见巨核细胞，胞质有糖原颗粒，与LSC-1第三代细胞形态相一致。

细胞倍体状况及细胞增殖周期分析结果。

用头孢哌酮/舒巴坦处理3次后， LSC-1细胞周期直方图虽为近二倍体图像，但S期、G2M期细胞峰较高，仍具有癌细胞的特点。裸鼠接种的LSC-1细胞呈现非整倍体图像，且二倍体和异倍体的S期、G2M期峰均较高，更接近第3代LSC-1细胞周期DNA含量分布。3种细胞各核型比例:裸鼠接种细胞仍保持二倍体和异倍体核型，分别占44. 92%和55. 08%，与第3代细胞(二倍体41. 52%、异倍体58. 48% )基本相同，而头孢哌酮/舒巴坦处理的细胞全部为二倍体，异倍体细胞消失。

六、讨论

挽救污染细胞的方法有抗生素除菌法、巨噬细胞吞噬法和动物接种除菌法，其中较常使用的是抗生素冲击法。清除效果的检验应包括无菌检验和细胞性状评估。无菌检验指细胞在无抗生素培养基中传代3~4次，显微镜下观察无细菌、培养上清细菌无菌生长，方可确定污染细菌被消除干净。细胞的组织来源鉴定和染色体分析是细胞系鉴定的两个主要方面。LSC-1为喉鳞状上皮来源细胞系，参照相关文献，我们选用角蛋白免疫组织化学鉴定和细胞周期DNA倍体分析方法评估细胞性状。

细胞系中麦芽窄食单胞菌有可能来源于标本本身。由于该菌对氨基糖甙类和很多B-内酰胺类(包括碳青霉烯类)天然耐药，故常规培养液中的青、链霉素不能*抑制其生长。有研究显示，该菌仅对少数几种抗生素如头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶等耐药性较低，本文得到了相同的结果。本实验采用15种抗生素对该菌的抑菌效果进行测定，找出其中有效的3种，又分别对这3种抗生素的6个梯度浓度测试，zui后确定抗菌效果zui好、细胞毒性zui小浓度为32 mg /L头孢哌酮/舒巴坦，其作用能控制细菌生长并使细胞传代2~3代，当联合使用小鼠巨噬细胞后又使细胞传代次数增加到5~6代。然而，抗生素的作用主要是通过抑制细菌细胞壁的合成达到抑制细菌生长的效果，并不能直接杀死细菌。有研究表明，单独使用抗生素处理细菌污染的KB口腔上皮样癌细胞系，不能*清除细胞内的细菌。巨噬细胞在体外没有其他免疫细胞和抗体等因素的参与下，其吞噬功能是有限的，在这里仅起到辅助抗生素的作用， (相关的报道有用于挽救支原体污染的细胞，但体外抗细菌的作用尚未见报道)，故当抗生素撤离后以上2种方法处理的细胞中细菌再次出现。

另外，抗生素对培养细胞的形态和性状都有一定的影响。本实验有效的3种抗生素中，头孢他啶毒性zui大，头孢哌酮/舒巴坦虽然毒性相对弱一些，但也使喉癌细胞角蛋白AE1 /AE3表达有所减少、DNA倍体分析原有的异倍体细胞消失，接种裸鼠后不能成瘤。因此可以认为，有针对性地使用抗生素或许可以短期控制住细胞系中污染细菌生长，但同时可能伴随有细胞生物学特性变化。进而推论，抗生素冲击法也难控制细菌再次暴发性生长，而且对细胞更有损伤。至于那些不做污染菌的分离和鉴定、仅靠单一某种广谱抗生素来对付所有污染细菌，或是仅参照临床用药剂量来设计抗生素浓度等做法更不可取。

动物体内接种除菌法是利用动物的免疫系统来消灭污染微生物的方法。常用的动物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠，其T细胞缺如致使特异性细胞免疫功能丧失，但B细胞功能依然正常以及非特异性细胞免疫系统NK细胞活力强，故可用于肿瘤细胞的污染清除。细菌在裸鼠体内可被巨噬细胞和中性粒细胞吞噬、NK细胞杀灭、IgM、IgG类抗体结合病菌后激活补体杀死或溶解等。本实验结果显示，接种BALB /c-nu裸鼠之后的LSC-1细胞形态良好、生长旺盛，细胞间没有细小微生物，传代多达8次后，细胞冻存和复苏仍能正常生长，并在抗生素撤离后细胞生长状态不变，细菌培养为阴性。

细胞生物学特性上，细胞角蛋白阳性表达比例较高，与第3代LSC-1接近，保持了原有上皮来源的性质，组织病理学观察仍具有高度的异型性及肿瘤细胞的特征，细胞倍体及增殖周期分析结果显示异倍体细胞及S期细胞的比例与第3代细胞相同。实验表明，利用裸鼠去除肿瘤细胞系中的污染细菌是zui为理想的方法，既能*清除污染细菌，又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。