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苏州千舍生物教你如何挽救细胞污染
发布时间:2020-03-13 点击量:269

苏州千舍生物教你如何挽救细胞污染

以自建细胞系(laryngeal squamous carcinoma-1LSC-1)第12代的某一被细菌污染的细胞株采取救治比较效果并分析细胞生物学特性。

一、实验方法

1抗生素法

细菌培养用无抗生素完全培养液培养细胞3 d收集上清离心后将沉淀物接种于血琼脂培养基35e培养。

所采用的抗生素包括临床常用的15种抗生素,抗生素zui适抑菌浓度筛选:根据细菌药敏实验结果选出敏感抗生素每种抗生素从zui低抑菌浓度MIC到zui高耐药浓度分别配制6个浓度梯度。将LSC-1细胞按1*104/孔种96孔板细胞贴壁后加入含敏感抗生素的完全培养液24 h后换无抗生素培养液培养1 d如此重复3次连续7 d。

2抗生素联合巨噬细胞吞噬法:

将上述抗生素处理过的细胞再用小鼠的巨噬细胞处理。巨噬细胞的制备:将灭菌的玻璃粉与0. 9%氯化钠注射液混和注入小鼠腹腔 3 d后脱颈处死动物无菌操作取小鼠腹腔液离心收集巨噬细胞与LSC-1细胞混合培养 3 d后换液弃去巨噬细胞。间隔一周后再用巨噬细胞共培养一次。

3裸鼠体内接种法:

将LSC-1细胞按1*106个/mL接种裸鼠腋下皮下连续观察当肿物长至约1cm3后脱颈处死动物无菌操作取出肿物采取组织块法做组织细胞培养。

二、效果鉴定

1、免疫组织化学鉴定

将上述3种方法处理的LSC-1细胞种植在直径为15 mm的无菌圆形盖玻片上贴壁后做角蛋白AE1 /AE3免疫组化染色、HE染色

2、细胞周期鉴定

采用流式细胞仪测量碘化丙啶标记细胞的荧光强度分析DNA含量。测试3种方法处理的LSC-1细胞周期并与该细胞建系初期的第3代细胞状况做比对。

3、抗生素撤离观察

用无抗生素的完全培养基培养3种方法处理的细胞连续观察3周取细胞上清做细菌培养。

Hyclone胎牛血清SH30084.03

Hyclone胎牛血清SH30406.02

Hyclone胎牛血清SH30406.05

Hyclone胎牛血清SH30396.03

Hyclone胎牛血清SH30070.03

特级胎牛血清 SH30070.03E

Hyclone胎牛血清 SH30370.03

活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03

活性炭/葡聚糖处理胎牛血清,热灭活 SH30068.03HI

马血清SH30074.03

乌拉圭胎牛血清 SV30087. 03

Hyclone胎牛血清SH30071.03

Hyclone胎牛血清SV30160.03

BOVOGEN胎牛血清 SFBS

BOVOGEN新生牛血清 SNCS

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101

PAA 优等胎牛血清FBS A15-151

BI优等胎牛血清 04-001-1ACS

BI ES级别胎牛血清 04-002-1A

BI 间充质胎牛血清 04-400-1A

Corning胎牛血清 35-076-CV

PAN胎牛血清FBS P30-3302

PAN胎牛血清FBS ST30-3302

PAN ES级别胎牛血清 ST30-2602

PAN胎牛血清Plus ST30-3302P

NTC优等胎牛血清 SFBE

Gemini优等胎牛血清 900-108

Gemini特级胎牛血清 100-500

Gemini科研用人AB血清100-512

TCB胎牛血清 101ZC

Sigma 特级胎牛血清F2442

Sigma正常人AB血清 H4522

SBI 无外泌体血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒装A31608-02、马血清16050-122

双抗15140-122、SV30010

胰酶 25200-056、SH30042.01

GIBCO 胰酶 25200-072

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐药株

HCT8/5-fu 人回肠直肠腺癌细胞五氟尿嘧啶耐药株

LOVO/5-FU 人结肠癌细胞五氟尿嘧啶耐药株

HCT116/L人结肠癌奥沙利铂耐药细胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病细胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌细胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人结肠癌细胞阿霉素耐药株

HNE1/DDP人鼻咽癌细胞顺铂耐药株

SGC7901/5-fu人胃癌细胞五氟尿嘧啶耐药株

A549/DDP人肺癌细胞顺铂耐药株

MCF-7/DDP人乳腺癌细胞顺铂耐药株

A549/ADR人肺癌细胞阿霉素耐药株

SGC7901/DDP人胃癌细胞顺铂耐药株

SKOV3/DDP人卵巢癌细胞顺铂耐药株

HELA/DDP人宫颈癌耐顺铂细胞株

NCI-H1650 人肺支气管癌细胞

RT4 人膀胱移行细胞乳头瘤

SK-N-MC 人神经上皮瘤细胞

SK-N-SH 人神经母细胞瘤细胞

SW982 人滑膜肉瘤细胞

T98G 人胶质母细胞瘤

U251MG(KO) 人类星形胶质细胞瘤细胞

U266 人骨髓瘤细胞

VCAP 人前列腺癌细胞

hTERT-HPNE 人胰腺导管细胞

ES-2 人卵巢透明细胞癌细胞

NCI-H1650人非小细胞肺癌细胞

H460 人大细胞肺癌细胞

HACAT 人永生化角质形成细胞

HCT116 人结肠癌细胞

HEK293 人胚肾细胞

HEPG2 人肝癌细胞

HGC27 人胃癌细胞(未分化)

HT-29 人结肠癌细胞

HUVEC 人脐静脉内皮细胞

KYSE150人食道癌细胞

L02(HL7702)人正常肝细胞  

LOVO 人结肠癌细胞

MCF-10A人正常乳腺上皮细胞

MCF7人乳腺癌细胞

LX-2 人肝星状细胞

MDA-MB-468人乳腺癌细胞

三、细胞系的维持、冻存与复苏:

将无抗生素培养3周的细胞按常规方法冻存并于1个月后复苏观察细胞生长状态。

四、结果

自建人喉癌细胞系LSC-1传至第12代以后细胞生长速度变慢已贴壁细胞变圆、漂起、死亡细胞间隙出现可运动的微小生物但培养液依然清亮不浑浊收取上清液离心将沉淀物行常规血琼脂培养 24 h结果为无菌生长培养5~7 d后开始出现灰白色细小菌落光滑湿润有透明溶血环全自动细菌鉴定仪生化鉴定条检测为嗜麦芽寡养食单胞菌该菌为非发酵革兰阴性杆菌。细菌药敏结果:在15种抗生素中该菌仅对头孢他啶、哌啦西林、头孢哌酮/舒巴坦3种药物敏感,其余均耐药。

4.1 抗生素法除菌效果

经筛选 LSC-1细胞可耐受的抗生素zui佳抑菌浓度分别为:哌啦西林64 mg /L、头孢他啶2 mg /L、头孢哌酮/舒巴坦32 mg /L。LSC-1细胞在哌啦西林和头孢他啶zui佳抑菌浓度中分别传代一次在头孢哌酮/舒巴坦中传代3次并每种细胞各冻存3株。复苏情况:哌啦西林3株均未贴壁头孢他啶两株复苏后贴壁但生长一周后均出现细菌细胞死亡;另一株第二次冻存再次复苏后生长良好但抗生素撤离后出现细菌经鉴定仍为嗜麦芽寡养食单胞菌。头孢哌酮/舒巴坦3株复苏后均能存活但生长缓慢一周传代一次仍有少量细菌抗生素撤离后重又出现细菌污染。在3种抗生素中头孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和细胞生长状态zui头孢他啶对细胞损伤较大细胞表面粗糙状态较差。

4.2 抗生素联合巨噬细胞吞噬法除菌效果

比较头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞先后使用和二者交替使用的除菌效果并观察细胞冻存复苏后的传代次数具体方法为:头孢哌酮/舒巴坦32 mg /L培养1次、2次、4次后再分别与巨噬细胞共培养2次各冻存1株;头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞交替培养3次冻存1株。复苏后细胞状态:头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞依次使用者中抗生素使用次数较多的细胞传代次数较多(5代);二者交替使用的细胞状态更好于前3株细胞且传代次数也zui多(6代)。然而所有细胞zui终因状态不佳或污染重现而死亡。

4.3裸鼠体内接种法除菌效果

肿瘤细胞接种裸鼠体内40 d后开始出现肿块 60d长至1 cm3左右。处死动物取出肿物瘤体质量0. 39 g体积为0. 8 cm*0. 6 cm*0. 4 cm。将组织块培养于含三抗的完全培养基 14 d后改用无抗生素培养持续培养3周细胞生长良好。之后自然传代8次冻存1个月后复苏细胞仍能贴壁生长。取上清液做细菌培养结果为无菌生长。

五、 细胞形态及生物学特性

抗生素处理及裸鼠接种后的LSC-1细胞形态与LSC-1第三代基本相同细胞呈多边形有铺路石感。

免疫组织化学细胞角蛋白染色裸鼠接种后的和抗生素处理的细胞均有AE1 /AE3阳性表达但前者阳性比例(图1H)与第三代细胞(图1G)接近后者阳性表达较少。

HE染色接种裸鼠的LSC-1细胞具有高度的异型性:细胞形态及大小不等;核呈多形性:大小、形态及染色各异胞核与胞质比例增大(接近1B1)核仁粗大数目增多核分裂象增多出现不对称、多极性等病理性核分裂偶见巨核细胞胞质有糖原颗粒与LSC-1第三代细胞形态相一致。

细胞倍体状况及细胞增殖周期分析结果

用头孢哌酮/舒巴坦处理3次后 LSC-1细胞周期直方图虽为近二倍体图像但S期、G2M期细胞峰较高仍具有癌细胞的特点。裸鼠接种的LSC-1细胞呈现非整倍体图像且二倍体和异倍体的S期、G2M期峰均较高更接近第3代LSC-1细胞周期DNA含量分布。3种细胞各核型比例:裸鼠接种细胞仍保持二倍体和异倍体核型分别占44. 92%和55. 08%与第3代细胞(二倍体41. 52%、异倍体58. 48% )基本相同而头孢哌酮/舒巴坦处理的细胞全部为二倍体异倍体细胞消失。

六、讨论

挽救污染细胞的方法有抗生素除菌法、巨噬细胞吞噬法和动物接种除菌法其中较常使用的是抗生素冲击法。清除效果的检验应包括无菌检验和细胞性状评估。无菌检验指细胞在无抗生素培养基中传代3~4次显微镜下观察无细菌、培养上清细菌无菌生长方可确定污染细菌被消除干净。细胞的组织来源鉴定和染色体分析是细胞系鉴定的两个主要方面。LSC-1为喉鳞状上皮来源细胞系参照相关文献我们选用角蛋白免疫组织化学鉴定和细胞周期DNA倍体分析方法评估细胞性状。

细胞系中麦芽窄食单胞菌有可能来源于标本本身。由于该菌对氨基糖甙类和很多B-内酰胺类(包括碳青霉烯类)天然耐药故常规培养液中的青、链霉素不能完全抑制其生长。有研究显示该菌仅对少数几种抗生素如头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶等耐药性较低本文得到了相同的结果。本实验采用15种抗生素对该菌的抑菌效果进行测定找出其中有效的3种又分别对这3种抗生素的6个梯度浓度测试,zui后确定抗菌效果zui好、细胞毒性zui小浓度为32 mg /L头孢哌酮/舒巴坦其作用能控制细菌生长并使细胞传代2~3代当联合使用小鼠巨噬细胞后又使细胞传代次数增加到5~6代。然而抗生素的作用主要是通过抑制细菌细胞壁的合成达到抑制细菌生长的效果并不能直接杀死细菌。有研究表明单独使用抗生素处理细菌污染的KB口腔上皮样癌细胞系不能完全清除细胞内的细菌。巨噬细胞在体外没有其他免疫细胞和抗体等因素的参与下其吞噬功能是有限的在这里仅起到辅助抗生素的作用 (相关的报道有用于挽救支原体污染的细胞但体外抗细菌的作用尚未见报道)故当抗生素撤离后以上2种方法处理的细胞中细菌再次出现。

另外抗生素对培养细胞的形态和性状都有一定的影响。本实验有效的3种抗生素中头孢他啶毒性zui头孢哌酮/舒巴坦虽然毒性相对弱一些但也使喉癌细胞角蛋白AE1 /AE3表达有所减少、DNA倍体分析原有的异倍体细胞消失接种裸鼠后不能成瘤。因此可以认为有针对性地使用抗生素或许可以短期控制住细胞系中污染细菌生长但同时可能伴随有细胞生物学特性变化。进而推论抗生素冲击法也难控制细菌再次暴发性生长而且对细胞更有损伤。至于那些不做污染菌的分离和鉴定、仅靠单一某种广谱抗生素来对付所有污染细菌或是仅参照临床用药剂量来设计抗生素浓度等做法更不可取。

动物体内接种除菌法是利用动物的免疫系统来消灭污染微生物的方法。常用的动物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠其T细胞缺如致使特异性细胞免疫功能丧失但B细胞功能依然正常以及非特异性细胞免疫系统NK细胞活力强故可用于肿瘤细胞的污染清除。细菌在裸鼠体内可被巨噬细胞和中性粒细胞吞噬、NK细胞杀灭、IgM、IgG类抗体结合病菌后激活补体杀死或溶解等。本实验结果显示接种BALB /c-nu裸鼠之后的LSC-1细胞形态良好、生长旺盛细胞间没有细小微生物传代多达8次后细胞冻存和复苏仍能正常生长并在抗生素撤离后细胞生长状态不变细菌培养为阴性。

细胞生物学特性上细胞角蛋白阳性表达比例较高与第3代LSC-1接近保持了原有上皮来源的性质组织病理学观察仍具有高度的异型性及肿瘤细胞的特征细胞倍体及增殖周期分析结果显示异倍体细胞及S期细胞的比例与第3代细胞相同。实验表明利用裸鼠去除肿瘤细胞系中的污染细菌是zui为理想的方法既能彻底清除污染细菌又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。

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