货号：WS010-100-KIT

品牌：WinSera

规格：100ml

操作步骤：
1、 原代

(1)取材后的肝癌组织须在 2 - 8℃含有组织保存液E的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离，拍照并登记信息。

(2)准备若干培养皿，加入 4℃预冷的肝癌类器官培养缓冲液 B备用

(3)取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用肝癌类器官培养缓冲液B清洗三次后，利用眼科剪或手术刀将肿瘤组织剪切成体积约为 1~3 mm3 的组织块。

(4)组织用肝癌原代组织消化液C消化，37℃震荡消化10-20 min，（消化过程中随时观察消化情况）。

(5)取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70μ m 以下的细胞簇后，加入三倍体积肝癌类器官培养缓冲液B终止消化。

(6)使用100μm孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加肝癌类器官培养缓冲液B重新重悬离心。

(7)基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板。

(8)24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。

(9)将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加肝癌类器官培养基A（恢复室温）进行培养。

2、 类器官传代培养

(1)移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液B放置2min。

(2)移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）

(3): 3.1类器官数量不足或体积较小时： 离心5min弃去上清，添加适量肝癌类器官缓冲液B重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。 3.2类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液D消化2-3min，添加肝癌类器官缓冲液B终止消化，离心5min弃去混合液，添加适量肝癌类器官缓冲液B重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。

(4)类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500μl肝癌类器官培养基A。

3、类器官冻存

(1)移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液B放置2min。

(2)移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）

(3) 离心5min弃去上清，添加适量肝癌类器官缓冲液B再次重悬，300g离心5min弃去液体。

(4)添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积1.4ml。

(5)做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存，

4、 类器官复苏

(1)取10ml肝癌类器官培养缓冲液B于15ml离心管中

(2)从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。

(3)水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2 分钟内w全融解。

(4)将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300g 离心 5分钟，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量肝癌类器官缓冲液B重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。

(5)基质胶重悬，每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min成胶，添加500μl肝癌类器官培养基A。

运用范围:

FOR LABORATORY RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

培养图片展示:

送样要求及癌种

样本的质量将极大影响类器官培养的成功率和效率，因此建议客户提供的样本需符合以下几项要求：