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类器官培养基操作指南(以肝癌为例)
更新时间:2023-03-23 点击量:505

货号:WS010-100-KIT


品牌:WinSera


规格:100ml


操作步骤:
1、 原代


(1)取材后的肝癌组织须在 2 - 8℃含有组织保存液E的取样瓶中,快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离,拍照并登记信息。

(2)准备若干培养皿,加入 4℃预冷的肝癌类器官培养缓冲液 B备用

(3)取样瓶消毒,将组织放入培养皿中,利用肝癌类器官培养缓冲液B清洗三次后,利用眼科剪或手术刀将肿瘤组织剪切成体积约为 1~3 mm3 的组织块。

(4)组织用肝癌原代组织消化液C消化,37℃震荡消化10-20 min,(消化过程中随时观察消化情况)。

(5)取少量液体在显微镜下观察,镜下观察到较多的单个细胞或 70μ m 以下的细胞簇后,加入三倍体积肝癌类器官培养缓冲液B终止消化。

(6)使用100μm孔径的筛网进行过滤,将滤液收集后,于300g富集离心5min后移去上清,添加肝癌类器官培养缓冲液B重新重悬离心。

(7)基质胶计算:第6步后观察收集到的组织体积,添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板。

(8)24孔细胞培养板为例,每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板(4℃下操作)。

(9)将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶,添加肝癌类器官培养基A(恢复室温)进行培养。

2、 类器官传代培养


(1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液B放置2min。

(2)移液抢轻柔吹打基质胶,收集在15ml离心管中,4℃静置10min。(每6-8孔为一组)

(3): 3.1类器官数量不足或体积较小时: 离心5min弃去上清,添加适量肝癌类器官缓冲液B重悬移入1.5ml离心管,300g离心5min弃去液体进行第4步。 3.2类器官数量较多或体积较大时:离心5min弃去上清,添加适量类器官传代消化液D消化2-3min,添加肝癌类器官缓冲液B终止消化,离心5min弃去混合液,添加适量肝癌类器官缓冲液B重悬移入1.5ml离心管,300g离心5min弃去液体进行第4步。

(4)类器官收集后,添加基质胶重悬,每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中,放置培养箱中10-15min添加500μl肝癌类器官培养基A。

3、类器官冻存


(1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液B放置2min。

(2)移液抢轻柔吹打基质胶,收集在15ml离心管中,4℃静置10min。(每6-8孔为一组)

(3) 离心5min弃去上清,添加适量肝癌类器官缓冲液B再次重悬,300g离心5min弃去液体。

(4)添加适量类器官冻存液 F,轻柔吹打重悬,以24孔细胞培养板为例:密度为2个孔冻存1管,每管体积1.4ml。

(5)做好标记信息,进行程序降温后,移入液氮长期保存,

4、 类器官复苏


(1)取10ml肝癌类器官培养缓冲液B于15ml离心管中

(2)从液氮罐中取出冻存的类器官细胞,快速置于 37℃水浴锅中融解。

(3)水浴融解过程中,需轻轻摇动冷冻管,以确保冻存液在 1-2 分钟内w全融解。

(4)将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管,使用移液管轻轻吹打6-8次,300g 离心 5分钟,然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量肝癌类器官缓冲液B重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。

(5)基质胶重悬,每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中,放置培养箱中10-15min成胶,添加500μl肝癌类器官培养基A。

运用范围:

FOR LABORATORY RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

培养图片展示:



送样要求及癌种


样本的质量将极大影响类器官培养的成功率和效率,因此建议客户提供的样本需符合以下几项要求:

 

样本类型与要求

新鲜胸腹液:  50~100 mL,低温无菌保存。

手术样品:  体积大于黄豆大小、越大越好,非纤维化激化灶(越大越好,于肿瘤边缘,12点、3点、6点与9点方向,各取一块),装入公司专门取样保持管,4度保存,标明样本信息,冷藏运输(48小时内)

穿刺样品:长于2 cm,装入样品瓶,4度保存,标明样本信息,冷藏运输。

培养周期

3-4周