交叉污染虽不如微生物污染普遍，但与HELA细胞及其他生长迅速的细胞系间广泛的交叉污染是个明确的问题，会造成严重后果。

从声誉好的细胞库获取细胞系、定期检查细胞系性质及采用良好的无菌技术有助于避免交叉污染。

通过DNA指纹图谱、核型分析和同位素分析可确认有无交叉污染。

血清与培养基

通常血清的添加比例为10%，当然也可根据细胞状态和生长速率适当增加或减少添加比例。在更换血清品牌或者批次时，最好需对血清的品质进行验证，防止对实验造成影响。

对于培养基，目前商品化的比较成熟，稳定性也较好。如若需自配培养基时，过滤前搅拌时间不宜过长（培养基中营养丰富，细菌常温下20min就可繁殖一代，其代谢产物会对培养细胞培养瓶

目前商品化的细胞培养瓶主要为瓶盖是否带气孔两种。其中不带透气孔细胞培养瓶拧紧后需适当回旋瓶盖，保证CO2能顺利进入细胞培养瓶。

细胞培养过程中，对于适应能力强的肿瘤细胞，可在传代3-4次后更换新的细胞培养瓶。对于非肿瘤细胞系如293T，HEK293等细胞，建议每次传代更换新的细胞培养瓶来保证细胞状态。

细胞传代

正常细胞形态较好，轮廓清晰，边缘透亮，细胞增殖状况良好。当贴壁细胞长到密度90%时，需进行传代。

传代时通常使用胰酶消化法。该方法又分为干消化法和湿消化法。

干消化法：胰酶浸润后弃去胰酶，待细胞变圆后加入新鲜培养基吹下后再进行细胞传代。

湿消化法：待细胞变圆，肉眼观察下成流沙状脱落时即可加入新鲜培养基终止消化，1000rpm离心5min,弃去上清，用新鲜培养基重悬传代。

吹打细胞时，手法要轻柔，避免吹打出气泡，造成细胞因内外压差破裂，同时需避免刮到壁影响细胞的贴壁。

不同细胞的贴壁能力不同，消化时间不同；不同细胞细胞间连接强度不一样，消化时间不同；同一细胞生长状状况不同，消化时间不同。消化时适时观察细胞形态，避免因过度消化影响细胞活性。

传代间隔时间和传代比例因细胞而异。细胞传代过程中，当细胞出现状态不好或者污染时及时弃去细胞，重新复苏。

细胞冻存与复苏

当细胞生长状况较好或者代数较早时，需及时大量的冻存。

细胞冻存液比例为培养基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。细胞冻存密度通常为1-3×106个/ml。细胞冻存采用慢冻方式，减少冰晶形成，避免细胞损伤。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞复苏时升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。38℃水浴不时摇动，在1分钟内使其*融化，1000rpm离心5min,弃去上清，用新鲜培养基重悬移入培养瓶中。

用真诚感动细胞

俗话说，心诚则灵。对待细胞培养也应如此，“自己要用的细胞自己养"，多去观察细胞生长状态。