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外泌体样本收集
更新时间:2022-02-16 点击量:1249

    外泌体是由细胞分泌的纳米级膜性小囊泡,直径约30~150nm。外泌体来源多样,广泛存在并分布于各种生物液体中,富含来源细胞的蛋白质、脂质和核酸,参与细胞间的信息交流。不同病理和生理条件下,外泌体的内容物不尽相同,因此外泌体可以很好地反映生物体的疾病与健康状态。此外,外泌体特殊的膜结构能够保护其内容物如RNAmicroRNAmRNAlncRNAcircRNA)免受酶的降解,保证其能在各类体液中被稳定检测到,因此外泌体是研究各种疾病的良好生物学材料,可作为肿瘤潜在的biomarker和治疗靶点,亦可作为基因/药物的递送载体,在疾病的诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。

据统计,2019年国自然中标的外泌体相关项目总计600多项,总金额高达2.5亿,相较2018年,总金额增长了44.5%,足可见外泌体研究的火热程度。近几年,随着高通量检测技术的飞速发展,对外泌体进行组学研究极大地推动了外泌体的研究进展。伯豪生物致力于科研服务,拥有高标准的样品处理平台、微阵列芯片平台、高通量测序平台、生物标志物平台、生物信息分析平台等多个平台,能够实现外泌体分离、鉴定、内含物(蛋白质、mRNAncRNA)检测及验证的“一站式”外泌体研究服务。

那么如何开展外泌体研究,第一步也是相当重要的一步就是收集外泌体含量高的样本。外泌体存在于各种生物体液中,如血液、乳汁、尿液,脑脊液,那么如何有效的收集各种类型的样本用于后续的外泌体分离呢,下面我们来简单介绍下各类型外泌体样本的具体收集方法。

注意:收集血清样本时一定不能加入抗凝剂。

 

1) 采集外周血(建议早晨空腹抽血),迅速转入不含EDTA的试管中;

 

2) 室温(22~25℃)下静置30分钟,或4℃下静置3~4小时,可见自行凝固;

 

3) 吸取上清至新的离心管中,4℃,8200×g离心10分钟;

 

4) 吸取上清至新的离心管中,4℃,16000×g离心10分钟;

 

5) 小心吸取上清至新的离心管中(1.5ml离心管,每管不超过1ml), -80℃保存;

 

6)干冰寄送样本。

 

提示:建议送样量5 mL 以上(大致需全血8-10mL

 

血浆

 

注意:收集血浆样本用于RNA研究时一定不要用肝素抗凝管。

 

1) 采集外周血(建议早晨空腹抽血),迅速转入EDTA抗凝管中,涡旋或颠倒混合510 次;

 

2) 1小时(室温)或2小时(4℃)内进行血浆分离,8200×g离心10分钟;

 

3) 吸取上清至新的离心管中,4℃,16000×g离心10分钟;

 

4) 小心吸取上清至新的离心管中(1.5ml离心管,每管不超过1ml),-80℃保存;

 

5)干冰寄送样本。

 

提示:建议送样量5 mL以上(大致需全血8-10mL

Tips: 血液样本外泌体研究血清好还是血浆好?

血浆=血液-血细胞;血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子;血清是血液凝固之后收集的液体,在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体,有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌,所以一般实验会选择血浆。在特殊情况下,如研究与血小板相关疾病的时候,血清比血浆更适合。此外,在采血后最好尽快处理样本,因血液收集到收集管后,血细胞和血小板会继续分泌外泌体

 

细胞上清

 

注意:细胞培养基必须使用去除外泌体的血清或者无血清培养基

 

1) 正常含有血清的培养基中培养细胞24h左右,贴壁细胞密度达到70%~80%,悬浮细胞密度达到60%~70%

 

2) 将原有血清培养基更换为去除外泌体的血清或者无血清培养基(贴壁细胞直接去除原有培养基,加入适量PBS缓冲液冲洗一次,更换新的培养基;悬浮细胞4℃,300×g离心10分钟,收集细胞后,加入适量PBS缓冲液冲洗一次,更换新的培养基)继续培养;

 

3) 培养48-72小时后,根据细胞数量确定收取上清时间;

 

4) 4℃,300×g,离心10分钟收集细胞上清;

 

5) 4℃,3000×g,离心15分钟,确保将细胞及细胞碎片去除干净;

 

6) 吸取上清,-80℃保存;

 

7)干冰寄送样本。

 

提示:送样量最好在50 mL 以上,不少于30ml

 

尿液

 

1) 收集清晨第一次尿液50ml,注意避免细菌污染,收集前注意饮食控制,前一晚22:00后禁食禁水;

 

2) 4 ℃ ,3000×g,离心15分钟,去除细胞或细胞碎片;

 

3) 收集上清尿液分装转移至15ml离心管中,-80℃保存;

 

4)干冰寄送样本。

 

提示:送样量最好在50 mL 以上

 

脑脊液

 

1) 收集脑脊液,收集过程中避免血液污染;

 

2) 3000×g,离心15分钟,去除细胞或细胞碎片;

 

3) 收集上清,-80℃冰箱中保存;

 

4)干冰寄送样本。

 

提示:送样量最好在20 mL 以上

 

注:以上建议的送样量综合考虑了外泌体的表征检测(TEMNTAWB)和组学研究(转录组、蛋白质组)的样本需求量。上述细胞上清送样量主要指常规肿瘤细胞,对于其他类型细胞,最好在送样前进行预实验,以确定外泌体含量。

 

目前外泌体的分离方法中应用广泛的是超速离心法和试剂盒抽提法,超速离心法是外泌体分离的金标准,是高分文章常用的分离方法,获得的外泌体纯度高。其原理主要是依据外泌体与其他微小囊泡密度和大小的不同而分离,通过逐步提高离心速度,有效去除细胞、细胞碎片和大囊泡,收集高纯度的外泌体。外泌体抽提试剂盒分离外泌体省时省力,外泌体纯度高,SBI外泌体抽提试剂盒,样本需求量少,最少可从100ul血清或5ml细胞上清中分离外泌体。利用超离或试剂盒法分离获得的外泌体,经表征检测确定后即可进行后续的组学研究。

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