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千舍生物推荐ELISA实验
发布时间:2020-04-01 点击量:197

酶联免疫吸附实验 ELISA

    一.实验目的
     酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。


    二.实验原理
    用于免疫酶技术的酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰胆碱酯酶,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中的氧化作用使颜色加深,无法准确地定量。 
     辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm,HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm,所以酶的浓度和纯度计算式是(已知HRP的A(1cm 403nm 1%)=25,式中1%指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ(Reinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右,最可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 

   ELISA的基本原理有三条: 
    (1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;
    (2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; 
    (3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。 
    ELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大,可概括四个方面: 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 
  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。 
  2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。 
  3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。 
  4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。 
  5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 
  6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O•D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O•D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。 

基本方法二 用于检测未知抗体的间接法: 
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml, 每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。 
↓ 
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 
↓ 
于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 
↓ 
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 

     (二) 酶与底物
    酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物

酶        底物        显色反应        测定波长
辣根过氧化物酶        邻苯二胺        橘红色        492*
        四甲替联苯胺        黄色        460**
        氨基水杨酸        棕色        449
        邻联苯甲        兰色        425
        2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐        蓝绿色        642
碱性磷酸酯酶        4-硝基酚磷酸盐(PNP)        黄色        400
        萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐        红色        500
葡萄糖氧化酶        ABTS+HRP+葡萄糖        黄色        405,420
        葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰        深蓝色        
β-D-半乳糖苷酶        甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)        荧光        360,450
        硝基酚半乳糖苷(ONPG)        黄色        420


     *  终止剂为2mol/L H2SO4
     ** 终止剂为2 mol/L柠檬酸, 不同的底物有不同的终止剂。
     可催化下列反应: HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体; A—— 为有色产物。

(三) ELISA常用的四种方法

    1.直接法测定抗原 
      将抗原吸附在载体表面;
      加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物;
      加底物。底物的降解量=抗原量。 

     2.间接法测定抗体
     将抗原吸附于固相载体表面;
      加抗体, 形成抗原-抗体复合物;
      加酶标抗体;
      加底物。 测定底物的降解量=抗体量。

    3.双抗体夹心法测定抗原
     将抗原免疫一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
     加抗原,形成抗原-抗体复合物; 
     加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物;
     加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 
     加底物。底物的降解量=抗原量。

    4. 竞争法测定抗原
    将抗体吸附在固相载体表面;
     (1) 加入酶标抗原;
     (2),(3)加入酶标抗原和待测抗原;
     加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。 

    三.仪器和材料

    1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔)。
    2. 酶联免疫检测仪
    3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
    4. 包被液::0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
     5. 稀释液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, 4℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20,0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
     6. 洗涤液:同稀释液
     7. 封闭液:0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS。
     8. 邻苯二胺溶液(底物):临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
     9. 终止液:2mol/LH2SO4。 

    四.  操作步骤
    1. 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置16~18小时。
    2. 洗涤:倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,最后将反应板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。
   3. 加封闭液200微升,37℃放置一小时。
   4. 洗涤同2。
   5. 加被检血清:用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
   6. 洗涤同2。
   7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
   8. 洗涤同2。
   9. 加底物:邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处10--15分钟。
   10. 加终止液:每孔50微升。
   11. 观察结果:用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

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